Макромолекулярная сборка

Термин макромолекулярная сборка (МА) относится к массивным химическим структурам, таким как вирусы и небиологические наночастицы , клеточные органеллы , мембраны , рибосомы и т. д., которые представляют собой сложные смеси полипептидов , полинуклеотидов , полисахаридов или других полимерных макромолекул . Обычно они относятся к более чем одному из этих типов, и смеси определяются пространственно (т. е. в отношении их химической формы), а также в отношении их основного химического состава и структуры . Макромолекулы встречаются в живых и неживых существах и состоят из многих сотен или тысяч атомов, удерживаемых вместе ковалентными связями ; они часто характеризуются повторяющимися звеньями (т. е. являются полимерами ). Их совокупности также могут быть биологическими или небиологическими, хотя термин МА чаще применяется в биологии, а термин супрамолекулярная сборка чаще применяется в небиологических контекстах (например, в супрамолекулярной химии и нанотехнологиях ). МА макромолекул удерживаются в определенных формах нековалентные межмолекулярные взаимодействия (а не ковалентные связи) и могут иметь либо неповторяющиеся структуры (например, как в архитектуре рибосомы (изображения) и клеточной мембраны ), либо повторяющиеся линейные, круговые, спиральные или другие структуры ( например, как в актиновых нитях и жгутиковом моторе , изображение). Процесс образования МА получил название молекулярной самосборки , этот термин особенно применяется в небиологическом контексте. Для изучения МА существует широкий спектр физических/биофизических, химических/биохимических и вычислительных методов; Учитывая масштаб (молекулярные размеры) МА, попытки разработать их состав и структуру, а также выявить механизмы, лежащие в основе их функций, находятся на переднем крае современной структурной науки.

Эукариотическая рибосома , которая каталитически переводит информацию, содержащуюся в молекулах мРНК , в белки. Анимация представляет этапы элонгации и мембранной трансляции эукариотической трансляции , показывая мРНК в виде черной дуги, субъединицы рибосомы - зеленым и желтым, тРНК - темно-синим, белки, такие как элонгация , и другие факторы, участвующие в светло-синем, - растущую полипептидную цепь. в виде черной нити, растущей вертикально от изгиба мРНК. В конце анимации полученный полипептид выдавливается через голубую пору SecY. ^[3] в серый интерьер отделения скорой помощи .

Биомолекулярный комплекс

Биомолекулярный комплекс , также называемый биомакромолекулярным комплексом , представляет собой любой биологический комплекс, состоящий из более чем одного биополимера ( белка , РНК , ДНК , ^[5]углеводы ) или крупные неполимерные биомолекулы ( липиды ). Взаимодействия между этими биомолекулами нековалентны. ^[6]Примеры:

Белковые комплексы , некоторые из которых являются мультиферментными : протеасома , голофермент ДНК-полимеразы III , голофермент РНК-полимеразы II , симметричные вирусные капсиды , комплекс шаперонинов GroEL - GroES , фотосистема I , АТФ-синтаза , ферритин .
РНК-белковые комплексы: рибосома , сплайсосома , свод , SnRNP . Такие комплексы в ядре клетки называются рибонуклеопротеинами (РНП).
ДНК-белковые комплексы: нуклеосома .
Белково-липидные комплексы: липопротеин . ^[7]^[8]

Структурно биомакромолекулярные комплексы изучают методами рентгеновской кристаллографии , ЯМР-спектроскопии белков , криоэлектронной микроскопии и последовательного одночастичного анализа , электронной томографии . ^[9]Модели атомной структуры, полученные с помощью рентгеновской кристаллографии и биомолекулярной ЯМР-спектроскопии, можно состыковать с гораздо более крупными структурами биомолекулярных комплексов, полученными с помощью методов более низкого разрешения, таких как электронная микроскопия, электронная томография и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей . ^[10]

Комплексы макромолекул встречаются повсеместно в природе, где участвуют в построении вирусов и всех живых клеток. Кроме того, они играют фундаментальную роль во всех основных жизненных процессах ( трансляция белков , деление клеток , транспорт везикул , внутри- и межклеточный обмен материала между компартментами и т. д.). В каждой из этих ролей сложные смеси организуются особым структурным и пространственным образом. В то время как отдельные макромолекулы удерживаются вместе за счет комбинации ковалентных связей и внутримолекулярных нековалентных сил (т.е. связей между частями внутри каждой молекулы посредством взаимодействий заряд-заряд , сил Ван-дер-Ваальса и диполь-дипольных взаимодействий, таких как водородные связи). ), по определению сами МА удерживаются вместе исключительно за счет нековалентных сил, за исключением того, что теперь они действуют между молекулами (т.е. межмолекулярными взаимодействиями ). ^{[ нужна ссылка ]}

Шкалы MA и примеры

Изображения выше дают представление о композиции и масштабе (размерах), связанных с МА, хотя они только начинают касаться сложности структур; в принципе, каждая живая клетка состоит из МА, но сама также является МА. В примерах и других подобных комплексах и сборках каждый из МА часто имеет молекулярную массу в миллионы дальтонов (мегадальтоны, т.е. в миллионы раз больше веса одного простого атома), хотя все еще имеет измеримые соотношения компонентов ( стехиометрии на некотором уровне ). точности. Как указано в подписях к изображениям, при правильном приготовлении МА или подкомплексы компонентов МА часто могут быть кристаллизованы для изучения с помощью кристаллографии белков и родственных методов или изучены другими физическими методами (например, спектроскопией , микроскопией ). ^{[ нужна ссылка ]}

Графическое изображение структуры вирусного МА, вируса мозаики вигны , с 30 копиями каждого из его белков оболочки, мелкого белка оболочки (S, желтый) и большого белка оболочки (L, зеленый), которые вместе с 2 молекулы с положительным смыслом РНК (РНК-1 и РНК-2, не видны) составляют вирион. Сборка очень симметрична и имеет диаметр ~ 280 Å (28 нм) в самом широком месте. ^{[ нужна проверка ]}^{[ нужна ссылка ]}

Вирусные структуры были одними из первых изученных МА; другие биологические примеры включают рибосомы (частичное изображение выше), протеасомы и комплексы трансляции (с компонентами белков и нуклеиновых кислот ), прокариотические и эукариотические транскрипционные комплексы, а также ядерные и другие биологические поры , которые обеспечивают проход материала между клетками и клеточными компартментами. Биомембраны также обычно считаются МА, хотя требования к структурному и пространственному определению изменены, чтобы учесть присущую молекулярную динамику мембранных липидов и белков внутри липидных бислоев . ^[15]

Сборка вируса

При сборке бактериофага (фага) Т4 вириона морфогенетические белки, кодируемые фаговыми генами, взаимодействуют друг с другом в характерной последовательности. Поддержание соответствующего баланса в количествах каждого из этих белков, вырабатываемых во время вирусной инфекции, по-видимому, имеет решающее значение для нормального морфогенеза фага Т4 . ^[16] Белки, кодируемые фагом Т4, которые определяют структуру вириона, включают основные структурные компоненты, второстепенные структурные компоненты и неструктурные белки, которые катализируют определенные этапы последовательности морфогенеза. ^[17]

Исследования в области магистратуры

Изучение структуры и функций МА является сложной задачей, в частности, из-за их размера в мегадальтонах, а также из-за их сложного состава и различной динамической природы. В большинстве случаев применялись стандартные химические и биохимические методы (методы очистки и центрифугирования белков , химическая и электрохимическая характеристика и т. д.). Кроме того, их методы исследования включают современные протеомные подходы, вычислительные и структурные методы с атомным разрешением (например, рентгеновскую кристаллографию ), малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и малоугловое рассеяние нейтронов (SANS), силовую спектроскопию. трансмиссионная электронная микроскопия и криоэлектронная микроскопия . Аарон Клуг был удостоен Нобелевской премии по химии 1982 года за работу по выяснению структуры с помощью электронной микроскопии, в частности, для белково-нуклеиновых кислотных МА, включая вирус табачной мозаики (структура, содержащая молекулу оцРНК из 6400 оснований и > 2000 молекул белка оболочки). . Кристаллизация и структурное решение рибосомы с молекулярной массой ~ 2,5 МДа, примера части белково-синтетического «механизма» живых клеток, было предметом исследования 2009 г. Нобелевская премия по химии присуждена Венкатраману Рамакришнану , Томасу А. Стейцу и Аде Э. Йонат . ^[18]

Небиологические аналоги

Наконец, биология не является единственной областью магистратуры. В каждой области супрамолекулярной химии и нанотехнологий есть области, которые были разработаны для разработки и расширения принципов, впервые продемонстрированных в биологических МА. Особый интерес в этих областях представляет разработка фундаментальных процессов молекулярных машин и расширение известных конструкций машин до новых типов и процессов. ^{[ нужна ссылка ]}

См. также

Многосостояние моделирования биомолекул
Четвертичная структура
Мультипротеиновый комплекс
Органелла : самое широкое определение «органеллы» включает не только мембраносвязанные клеточные структуры, но и очень большие биомолекулярные комплексы.
Многосостояние моделирования биомолекул

Ссылки

^ Бан Н., Ниссен П., Хансен Дж., Мур П.Б., Стейц Т.А. (август 2000 г.). «Полная атомная структура большой субъединицы рибосомы с разрешением 2,4 А». Наука . 289 (5481): 905–920. Бибкод : 2000Sci...289..905B . CiteSeerX 10.1.1.58.2271 . дои : 10.1126/science.289.5481.905 . ПМИД 10937989 .
^ МакКлюр В. «Субъединица рибосомы 50S» . Архивировано из оригинала 24 ноября 2005 г. Проверено 9 октября 2019 г.
^ Осборн А.Р., Рапопорт Т.А., ван ден Берг Б. (2005). «Транслокация белков по каналу Sec61/SecY». Ежегодный обзор клеточной биологии и биологии развития . 21 : 529–550. doi : 10.1146/annurev.cellbio.21.012704.133214 . ПМИД 16212506 .
^ Легенда, обложка, J. Bacteriol., октябрь 2006 г. ^{[ нужна полная цитата ]}
^ Кляйнджунг Дж., Братья Ф. (июль 2005 г.). «POPSCOMP: автоматизированный анализ взаимодействия биомолекулярных комплексов» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (проблема с веб-сервером): W342–W346. дои : 10.1093/nar/gki369 . ПМК 1160130 . ПМИД 15980485 .
^ Мур П.Б. (2012). «Как нам следует относиться к рибосоме?». Ежегодный обзор биофизики . 41 (1): 1–19. doi : 10.1146/annurev-biophys-050511-102314 . ПМИД 22577819 .
^ Нойман Н. (январь 2016 г.). «Сложный макромолекулярный комплекс» . Тенденции биохимических наук . 41 (1): 1–3. дои : 10.1016/j.tibs.2015.11.006 . ПМИД 26699226 .
^ Дутта С., Берман HM (март 2005 г.). «Большие макромолекулярные комплексы в Банке данных белков: отчет о состоянии» . Структура . 13 (3): 381–388. дои : 10.1016/j.str.2005.01.008 . ПМИД 15766539 .
^ Рассел Р.Б., Альбер Ф., Элой П., Дэвис Ф.П., Коркин Д., Пишо М. и др. (июнь 2004 г.). «Структурный взгляд на белок-белковые взаимодействия». Современное мнение в области структурной биологии . 14 (3): 313–324. дои : 10.1016/j.sbi.2004.04.006 . ПМИД 15193311 .
^ ван Дейк А.Д., Боеленс Р., Бонвин А.М. (январь 2005 г.). «Докинг на основе данных для изучения биомолекулярных комплексов». Журнал ФЭБС . 272 (2): 293–312. дои : 10.1111/j.1742-4658.2004.04473.x . hdl : 1874/336958 . ПМИД 15654870 . S2CID 20148856 .
^ «Структура жидких липидных бислоев» . Blanco.biomol.uci.edu. 10 ноября 2009 г. Проверено 9 октября 2019 г.
^ Экспериментальная система, бислои диолеоилфосфатидилхолина . Гидрофобная углеводородная область липида составляет ~ 30 Å (3,0 нм), что определено комбинацией методов рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей; аналогично, полярная/межфазная область (глицерил, фосфат и фрагменты головной группы с их совместной гидратацией) составляет ~ 15 Å (1,5 нм) с каждой стороны , а общая толщина примерно равна углеводородной области. См. ссылки на SH White, предшествующие и последующие.
^ Винер MC, White SH (февраль 1992 г.). «Структура жидкого бислоя диолеоилфосфатидилхолина, определенная совместным уточнением данных рентгеновской и нейтронной дифракции. III. Полная структура» . Биофизический журнал . 61 (2): 434–447. Бибкод : 1992BpJ....61..434W . дои : 10.1016/S0006-3495(92)81849-0 . ПМЦ 1260259 . ПМИД 1547331 .
^ Размеры углеводородов варьируются в зависимости от температуры, механического напряжения, структуры PL и сокомпонентов и т. д. в пределах от однозначных до небольших двузначных процентов от этих значений. ^{[ нужна ссылка ]}
^ Герле С (июнь 2019 г.). «Очерк структуры биомембраны» . Журнал мембранной биологии . 252 (2–3): 115–130. дои : 10.1007/s00232-019-00061-w . ПМК 6556169 . ПМИД 30877332 .
^ Этаж Е (февраль 1970 г.). «Взаимодействие морфогенетических генов бактериофага Т4». Журнал молекулярной биологии . 47 (3): 293–306. дои : 10.1016/0022-2836(70)90303-7 . ПМИД 4907266 .
^ Снустад Д.П. (август 1968 г.). «Взаимодействия доминирования в клетках Escherichia coli, смешанно инфицированных бактериофагом T4D дикого типа и янтарными мутантами, и их возможные последствия в отношении типа функции гена-продукта: каталитическая или стехиометрическая». Вирусология . 35 (4): 550–63. дои : 10.1016/0042-6822(68)90285-7 . ПМИД 4878023 .
^ «Нобелевская премия по химии 2009» . Нобелевская премия . Нобелевская премия AB 2021 . Проверено 10 мая 2021 г.

Дальнейшее чтение

Общие отзывы

Уильямсон-младший (август 2008 г.). «Кооперативность в сборке макромолекул». Химическая биология природы . 4 (8): 458–465. дои : 10.1038/nchembio.102 . ПМИД 18641626 .
Перракис А., Мусаккио А., Кьюсак С., Петоза С. (август 2011 г.). «Исследование макромолекулярного комплекса: инструментарий методов». Журнал структурной биологии . 175 (2): 106–12. дои : 10.1016/j.jsb.2011.05.014 . ПМИД 21620973 .
Даффорн Т.Р. (январь 2007 г.). «Так как же узнать, что у вас есть макромолекулярный комплекс?» . Акта Кристаллографика. Раздел D. Биологическая кристаллография . 63 (Часть 1): 17–25. дои : 10.1107/S0907444906047044 . ПМЦ 2483502 . ПМИД 17164522 .
Вольгемут I, Ленц С, Урлауб Х (март 2015 г.). «Изучение стехиометрии макромолекулярных комплексов методом масс-спектрометрии на основе пептидов» . Протеомика . 15 (5–6): 862–79. дои : 10.1002/pmic.201400466 . ПМК 5024058 . ПМИД 25546807 .
Синха С., Арора К., Мун С.С., Ярлагадда С., Вудруфф К., Нарен А.П. (октябрь 2014 г.). «Резонансная передача энергии Фёрстера - подход к визуализации пространственно-временной регуляции образования макромолекулярных комплексов и передачи сигналов в разделенных клетках» . Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1840 (10): 3067–72. дои : 10.1016/j.bbagen.2014.07.015 . ПМЦ 4151567 . ПМИД 25086255 .
Берг Дж. М., Тимочко Дж., Страйер Л. (2002). Биохимия (5-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-4955-4 .
Ленинджер А.Л., Кокс М., Нельсон Д.Л. (2005). Ленингерские принципы биохимии (Четвертое изд.). Нью-Йорк: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-4339-2 .

Обзоры отдельных МА

Валле М (май 2011 г.). «Почти потеряно в переводе. Крио-ЭМ динамического макромолекулярного комплекса: рибосомы». Европейский биофизический журнал . 40 (5): 589–97. дои : 10.1007/s00249-011-0683-6 . ПМИД 21336521 . S2CID 26027815 .
Мони ТП (2017). «Каноническая инфламмасома: макромолекулярный комплекс, вызывающий воспаление». Макромолекулярные белковые комплексы . Субклеточная биохимия. Том. 83. стр. 43–73. дои : 10.1007/978-3-319-46503-6_2 . ISBN 978-3-319-46501-2 . ПМИД 28271472 .
Перино А., Гиго А., Дамилано Ф., Хирш Э. (август 2006 г.). «Идентификация макромолекулярного комплекса, ответственного за PI3Kgamma-зависимую регуляцию уровней цАМФ». Труды Биохимического общества . 34 (Часть 4): 502–3. дои : 10.1042/BST0340502 . ПМИД 16856844 .

Первоисточники

Ласкер К., Фёрстер Ф., Бон С., Вальцтхени Т., Вилла Е., Унвердорбен П. и др. (январь 2012 г.). «Молекулярная архитектура голокомплекса 26S протеасом, определенная интегративным подходом» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (5): 1380–1387. Бибкод : 2012PNAS..109.1380L . дои : 10.1073/pnas.1120559109 . ПМК 3277140 . ПМИД 22307589 .
Рассел Д., Ласкер К., Уэбб Б., Веласкес-Мюриэль Дж., Чиое Э., Шнайдман-Духовны Д. и др. (январь 2012 г.). «Соединяем детали: программное обеспечение платформы интегративного моделирования для определения структуры макромолекулярных ансамблей» . ПЛОС Биология . 10 (1): e1001244. дои : 10.1371/journal.pbio.1001244 . ПМК 3260315 . ПМИД 22272186 .
Бархум С., Палит С., Йетирадж А. (май 2016 г.). «Диффузионные ЯМР-исследования образования макромолекулярных комплексов, скученности и удержания в мягких материалах». Прогресс в спектроскопии ядерного магнитного резонанса . 94–95: 1–10. дои : 10.1016/j.pnmrs.2016.01.004 . ПМИД 27247282 .

Другие источники

Нобелевские премии по химии (2012 г.), Нобелевская премия по химии 2009 г., Венкатраман Рамакришнан, Томас А. Стейц, Ада Э. Йонат, Нобелевская премия по химии 2009 г. , по состоянию на 13 июня 2011 г.
Нобелевские премии по химии (2012 г.), Нобелевская премия по химии 1982 г., Аарон Клуг, Нобелевская премия по химии 1982 г. , по состоянию на 13 июня 2011 г.

Внешние ссылки

Beck Group (2019), Структура и функции больших макромолекулярных ансамблей (домашняя страница группы Beck), Beck Group - Структура и функции больших молекулярных ансамблей - EMBL , по состоянию на 13 июня 2011 г.
Группа ДМА (2019), Динамика сборки макромолекул (домашняя страница Группы ДМА), Раздел «Динамика сборки макромолекул» | Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии , по состоянию на 13 июня 2011 г.

[Ban-1] Бан Н., Ниссен П., Хансен Дж., Мур П.Б., Стейц Т.А. (август 2000 г.). «Полная атомная структура большой субъединицы рибосомы с разрешением 2,4 А». Наука . 289 (5481): 905–920. Бибкод : 2000Sci...289..905B . CiteSeerX 10.1.1.58.2271 . дои : 10.1126/science.289.5481.905 . ПМИД 10937989 .

[2] МакКлюр В. «Субъединица рибосомы 50S» . Архивировано из оригинала 24 ноября 2005 г. Проверено 9 октября 2019 г.

[pmid16212506-3] Осборн А.Р., Рапопорт Т.А., ван ден Берг Б. (2005). «Транслокация белков по каналу Sec61/SecY». Ежегодный обзор клеточной биологии и биологии развития . 21 : 529–550. doi : 10.1146/annurev.cellbio.21.012704.133214 . ПМИД 16212506 .

[4] Легенда, обложка, J. Bacteriol., октябрь 2006 г. ^{[ нужна полная цитата ]}

[biomolecular_complex_protein_DNA_RNA_2005-5] Кляйнджунг Дж., Братья Ф. (июль 2005 г.). «POPSCOMP: автоматизированный анализ взаимодействия биомолекулярных комплексов» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (проблема с веб-сервером): W342–W346. дои : 10.1093/nar/gki369 . ПМК 1160130 . ПМИД 15980485 .

[Ribosome_macromolecular_device_2012_REVIEW-6] Мур П.Б. (2012). «Как нам следует относиться к рибосоме?». Ежегодный обзор биофизики . 41 (1): 1–19. doi : 10.1146/annurev-biophys-050511-102314 . ПМИД 22577819 .

[Trends_in_biochemical_sciences_2015-7] Нойман Н. (январь 2016 г.). «Сложный макромолекулярный комплекс» . Тенденции биохимических наук . 41 (1): 1–3. дои : 10.1016/j.tibs.2015.11.006 . ПМИД 26699226 .

[Structure_2005-8] Дутта С., Берман HM (март 2005 г.). «Большие макромолекулярные комплексы в Банке данных белков: отчет о состоянии» . Структура . 13 (3): 381–388. дои : 10.1016/j.str.2005.01.008 . ПМИД 15766539 .

[9] Рассел Р.Б., Альбер Ф., Элой П., Дэвис Ф.П., Коркин Д., Пишо М. и др. (июнь 2004 г.). «Структурный взгляд на белок-белковые взаимодействия». Современное мнение в области структурной биологии . 14 (3): 313–324. дои : 10.1016/j.sbi.2004.04.006 . ПМИД 15193311 .

[10] ван Дейк А.Д., Боеленс Р., Бонвин А.М. (январь 2005 г.). «Докинг на основе данных для изучения биомолекулярных комплексов». Журнал ФЭБС . 272 (2): 293–312. дои : 10.1111/j.1742-4658.2004.04473.x . hdl : 1874/336958 . ПМИД 15654870 . S2CID 20148856 .

[11] «Структура жидких липидных бислоев» . Blanco.biomol.uci.edu. 10 ноября 2009 г. Проверено 9 октября 2019 г.

[12] Экспериментальная система, бислои диолеоилфосфатидилхолина . Гидрофобная углеводородная область липида составляет ~ 30 Å (3,0 нм), что определено комбинацией методов рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей; аналогично, полярная/межфазная область (глицерил, фосфат и фрагменты головной группы с их совместной гидратацией) составляет ~ 15 Å (1,5 нм) с каждой стороны , а общая толщина примерно равна углеводородной области. См. ссылки на SH White, предшествующие и последующие.

[13] Винер MC, White SH (февраль 1992 г.). «Структура жидкого бислоя диолеоилфосфатидилхолина, определенная совместным уточнением данных рентгеновской и нейтронной дифракции. III. Полная структура» . Биофизический журнал . 61 (2): 434–447. Бибкод : 1992BpJ....61..434W . дои : 10.1016/S0006-3495(92)81849-0 . ПМЦ 1260259 . ПМИД 1547331 .

[14] Размеры углеводородов варьируются в зависимости от температуры, механического напряжения, структуры PL и сокомпонентов и т. д. в пределах от однозначных до небольших двузначных процентов от этих значений. ^{[ нужна ссылка ]}

[15] Герле С (июнь 2019 г.). «Очерк структуры биомембраны» . Журнал мембранной биологии . 252 (2–3): 115–130. дои : 10.1007/s00232-019-00061-w . ПМК 6556169 . ПМИД 30877332 .

[pmid4907266-16] Этаж Е (февраль 1970 г.). «Взаимодействие морфогенетических генов бактериофага Т4». Журнал молекулярной биологии . 47 (3): 293–306. дои : 10.1016/0022-2836(70)90303-7 . ПМИД 4907266 .

[pmid4878023-17] Снустад Д.П. (август 1968 г.). «Взаимодействия доминирования в клетках Escherichia coli, смешанно инфицированных бактериофагом T4D дикого типа и янтарными мутантами, и их возможные последствия в отношении типа функции гена-продукта: каталитическая или стехиометрическая». Вирусология . 35 (4): 550–63. дои : 10.1016/0042-6822(68)90285-7 . ПМИД 4878023 .

[18] «Нобелевская премия по химии 2009» . Нобелевская премия . Нобелевская премия AB 2021 . Проверено 10 мая 2021 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]