Осаждение сульфатом аммония
Осаждение сульфатом аммония является одним из наиболее часто используемых методов очистки и фракционирования белков в больших и лабораторных масштабах, который можно использовать для разделения белков путем изменения их растворимости в присутствии высокой концентрации соли.
Характеристики
[ редактировать ]Сульфат аммония представляет собой неорганическую соль с высокой растворимостью, которая диссоциирует на аммоний ( NH +
4 ) и сульфат ( SO 2−
4 ) в водных растворах. [1] Сульфат аммония особенно полезен в качестве осадителя, поскольку он хорошо растворим, стабилизирует структуру белка, имеет относительно низкую плотность, легко доступен и относительно недорог.
Механизм
[ редактировать ]Сульфат аммония, как и другие нейтральные соли, стабилизирует белки путем преимущественной сольватации . Белки обычно хранятся в сульфате аммония, поскольку он подавляет рост бактерий. При добавлении сульфата аммония белки, развернутые денатурантами, могут быть переведены в их нативную конформацию. Это можно увидеть на примере сворачивания рекомбинантных белков. [2]
Растворимость белков варьируется в зависимости от ионной силы раствора, то есть от концентрации соли. При низких концентрациях ионов (менее 0,5 моль/л) растворимость белков увеличивается с увеличением концентрации соли – эффект, получивший название « высаливания ». По мере дальнейшего увеличения концентрации соли растворимость белка начинает снижаться. При достаточно высокой ионной силе белок выпадает в осадок из раствора, этот эффект называется « высаливанием ». [3] Когда аммоний ( NH +
4 ) и сульфат ( SO 2−
4 ) ионы находятся в водном растворе, они притягиваются к противоположным зарядам, наблюдаемым на очищаемом соединении. Это притяжение противоположных зарядов предотвращает взаимодействие молекул воды с очищаемым соединением, что приводит к осаждению или «высаливанию». [2]
Белки заметно различаются по растворимости при высокой ионной силе, поэтому «высаливание» — очень полезная процедура, способствующая очистке нужного белка. Сульфат аммония обычно используют для осаждения из-за его высокой растворимости, кроме того, он образует два иона высокого уровня в ряду Хофмейстера . Поскольку эти два иона находятся в конце ряда Хофмейстера, сульфат аммония также может стабилизировать структуру белка. [3] Поведение белка по растворимости сульфата аммония обычно выражается как функция процента насыщения. Кривую растворимости можно определить путем построения логарифма экспериментально определенной растворимости, выраженной в мг/мл, в зависимости от процентного насыщения сульфата аммония. [4]
При механизме высаливания происходит выпадение соли из слоя воды, тесно связанного с поверхностью белка, известного как гидратный слой. Гидратный слой играет жизненно важную роль в поддержании растворимости и подходящей естественной конформации. Существует три основных взаимодействия белок-вода: гидратация ионов между заряженными боковыми цепями, водородная связь между полярными группами и водой и гидрофобная гидратация. После добавления соли в смесь поверхностное натяжение воды увеличивается, тем самым увеличивая гидрофобные взаимодействия между водой и интересующим белком. Затем интересующий белок уменьшает площадь своей поверхности, что уменьшает его контакт с растворителем. Об этом свидетельствует складчатость и самоассоциация, что в конечном итоге приводит к осаждению. Сворачивание и самоассоциация белка выталкивают свободную воду, что приводит к увеличению энтропии и делает этот процесс энергетически выгодным. [2]
Процедура
[ редактировать ]Обычно концентрацию сульфата аммония повышают ступенчато, и на каждом этапе извлекают осажденный белок. Обычно это делается добавлением твердого сульфата аммония; однако расчет количества сульфата аммония, которое следует добавить в раствор для достижения желаемой концентрации, может быть затруднен, поскольку добавление сульфата аммония значительно увеличивает объем раствора. Количество сульфата аммония, которое следует добавить в раствор, можно определить по опубликованным номограммам или с помощью онлайн-калькулятора. [5] Непосредственное добавление твердого сульфата аммония изменяет pH раствора, что может привести к потере активности фермента. [6] В этих случаях добавление насыщенного сульфата аммония в подходящем буфере используется в качестве альтернативы добавлению твердого сульфата аммония. При любом подходе полученный осадок белка можно индивидуально растворить в стандартном буфере и проанализировать для определения общего содержания белка.
Концентрацию добавляемого сульфата аммония следует увеличить до значения, которое приведет к осаждению большей части интересующего белка, в то же время оставляя максимальное количество белковых примесей в растворе. Осажденный интересующий белок впоследствии может быть выделен центрифугированием и растворен в стандартном буфере, чтобы подготовить образец для следующего этапа очистки.
На следующем этапе очистки всю эту добавленную соль необходимо удалить из белка. Один из способов сделать это — использовать диализ, но диализ еще больше разбавляет концентрированный белок. Лучшим способом удаления сульфата аммония из белка является смешивание осадка белка в буфере, содержащем смесь SDS, трис-HCl и фенола, и центрифугирование смеси. Осадок, полученный в результате центрифугирования, будет содержать бессолевой концентрированный белок. [7]
Приложения
[ редактировать ]Осаждение сульфатом аммония является полезным методом в качестве начального этапа очистки белков, поскольку оно обеспечивает быстрое и массовое осаждение клеточных белков. [4] Его также часто используют на более поздних стадиях очистки для концентрирования белка из разбавленного раствора после таких процедур, как гель-фильтрация . Недостатком этого метода является то, что часто вместе с белком могут осаждаться различные вещества, и необходимо применять другие методы очистки, такие как ионная хроматография или эксклюзионная хроматография . [3]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Сульфат аммония» . ПабХим . Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США . Проверено 5 мая 2017 г.
- ^ Jump up to: а б с Вингфилд П. (май 2001 г.). «Осаждение белков сульфатом аммония» . Современные протоколы в науке о белках . Приложение 3 (1): A.3F.1–A.3F.8. дои : 10.1002/0471140864.psa03fs13 . ISBN 0471140864 . ПМЦ 4817497 . ПМИД 18429073 .
- ^ Jump up to: а б с Дуонг-Ли К.К., Габелли С.Б. (2014). «Высаливание белков осаждением сульфатом аммония». Лабораторные методы в энзимологии: Белок, часть C. Том. 541. стр. 85–94. дои : 10.1016/B978-0-12-420119-4.00007-0 . ISBN 9780124201194 . ПМИД 24674064 .
- ^ Jump up to: а б Берджесс Р.Р. (2009). «Глава 20. Методы осаждения белков». Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы энзимологии. Том. 463. стр. 331–42. дои : 10.1016/S0076-6879(09)63020-2 . ISBN 978-0-12-374536-1 . ПМИД 19892180 .
- ^ «Калькулятор сульфата аммония» . ЭнКор Биотехнология Инк . Проверено 19 апреля 2013 г.
- ^ Арсланян, Майкл Дж.; Вакиль, Салих Дж. (1 января 1975 г.). «[7a] Синтаза жирных кислот из куриной печени» . Липиды Часть Б. Методы энзимологии. Том. 35. С. 59–65. дои : 10.1016/0076-6879(75)35138-0 . ISBN 9780121819354 . ISSN 0076-6879 . ПМИД 235706 . Проверено 31 октября 2020 г.
- ^ Ван В, Лю QJ, Цуй Х (июль 2007 г.). «Быстрое обессоливание и восстановление белка фенолом после фракционирования сульфатом аммония». Электрофорез . 28 (14): 2358–60. дои : 10.1002/elps.200600743 . ПМИД 17577882 . S2CID 33402573 .