Свободнопоточный электрофорез

Свободнопоточный электрофорез ( FFE ), также известный как электрофорез без носителя , представляет собой безматричный метод высоковольтного электрофоретического разделения. FFE — это метод, аналогичный капиллярному электрофорезу , с сопоставимым разрешением, который можно использовать для научных вопросов, когда необходимы полупрепаративные и препаративные количества образцов. Он используется для количественного разделения образцов в соответствии с различиями в заряде или изоэлектрической точке путем формирования градиента pH . Благодаря универсальности метода существует широкий спектр протоколов разделения таких образцов, как редких металлов ионы , изоформы белков , мультибелковые комплексы , пептиды , органеллы , клетки , ДНК-оригами , сыворотка крови и наночастицы . Преимущество FFE заключается в быстром и бережном разделении образцов, растворенных в жидком растворителе, без необходимости использования матрицы, как это происходит с полиакриламидом при гель-электрофорезе . Это обеспечивает очень высокую степень извлечения, поскольку аналиты не прилипают к какой-либо структуре носителя или матрицы. Благодаря непрерывному характеру и высокой объемной производительности этот метод позволяет быстро разделять препаративные количества образцов с очень высоким разрешением. Кроме того, разделение можно проводить в нативных или денатурирующих условиях. ^[1]

История

FFE был разработан в 1960-х годах Куртом Ханнигом в Институте Макса Планка в Германии. ^[2] До 1980-х годов это была стандартизированная технология разделения клеток и органелл , а FFE даже тестировалась в космосе, чтобы минимизировать седиментацию в условиях невесомости . ^[3] Поскольку проточная цитометрия стала стандартным методом сортировки клеток, разработки FFE были сосредоточены на разделении белков и заряженных частиц. Некоторые группы также работают над миниатюрными версиями систем FFE или микро-FFE. ^[4]

Техника

Сепарационная камера состоит из задней и передней пластин. Задняя панель обычно состоит из охлаждаемого алюминиевого блока, покрытого зеркалом из стекла с пластиковым покрытием. Передняя панель в настоящее время изготавливается из ПММА , раньше использовалось стекло. Расстояние между передней и задней пластинами можно регулировать с помощью прокладок и обычно оно составляет 0,1–0,5 мм. На передней панели также расположены входы для разделительных буферов и пробы, выходы для фракционирующих трубок и платиновые провода в качестве электродов. Применяя различные буферы к нескольким входным отверстиям для буфера, оператор может изменять pH, концентрацию солей или состав и, следовательно, условия разделения по ширине камеры.Разделительные буферы и образец подаются перистальтическим насосом для обеспечения ламинарного потока . высокого напряжения Электрическое поле прикладывается перпендикулярно ламинарному потоку. Аналиты в ламинарном потоке можно разделить по плотности заряда и изоэлектрической точке . Благодаря своей универсальности в этом методе можно использовать различные режимы электрофореза, такие как, например, изотахофорез, изоэлектрофокусирование или (интервальный) зональный электрофорез. ^{[ нужна ссылка ]}

В конце сепарационной ячейки отделенный образец разделяется в пробирках для фракционирования и собирается в микротитровальные планшеты. ^[5]

Схематическая функциональность электрофореза в свободном потоке

После этого образцы можно охарактеризовать всеми основными методами, такими как ВЭЖХ , ЖХ-МС , масс-спектрометрия ( ESI / MALDI , в зависимости от используемого протокола) или электрофорез (IEF/ SDS PAGE , 2D-PAGE ). ^{[ нужна ссылка ]}

Приложения

Стандартное применение включает разделение с высоким разрешением белковых комплексов, мембранных белков, изоформ белков и антител, клеток, субклеточных компартментов (например, органелл, рибосом) и липосом. ^[6] Используя очень пологие градиенты pH, создаваемые амфолитами , можно разделять изоформы белка, которые различаются менее чем на 0,02 единицы pH, с производительностью около 3 мг/ч. ^[7]Также в буферы можно добавлять добавки для увеличения разрешения или денатурации образцов. Обычно концентрации мочевины до 8М, 0,1–1% моющих средств, таких как: CHAPS, CHAPSO, дигитонин, додецил-β-D-мальтозид, октил-β-D-глюкозид, тритон-X-114 (IEF) и DTT до 50 мМ переносятся. ^{[ нужна ссылка ]}

Ключевые особенности

Разделение без матрицы, идеальное для сохранения активности белка/белковых комплексов
Разделение белковых комплексов, мембранных белков, изоформ белков, клеток, субклеточных компартментов (например, органелл, рибосом и т. д.) с высоким разрешением.
Диапазон размеров разделения от ионов до целых ячеек
Выход пробы до 99%, в зависимости от пробы и режима работы.
Высокая воспроизводимость отдельных прогонов
Разлука за несколько минут
Протоколы разделения изоэлектрофокусировкой различных коммерческих амфолитов и атоксичных низкомолекулярных ProLytesTM для прямого клинического применения.
Быстрое и чувствительное определение качества разделения с помощью УФ-гелей и IEF-гелей.
Совместим со многими другими последующими методами, например, ВЭЖХ, МС, ДСН, ИЭФ и 2D-GE.
Подходит для разделения нестабильных белков за счет охлаждения образцов и камеры разделения до 4 °C.
Уменьшение сложности протеома перед дальнейшим протеомным анализом. ^[8]
Обогащение малообеспеченных белков путем удаления избытка нежелательных белков
Совместим с большими и малыми объемами проб от 50 мкл до нескольких миллилитров.
Препаративный и аналитический режимы работы
Поддерживает все режимы электрофоретического разделения (IEF, IZE, ZE, ITP).
Может работать в нативных или денатурирующих условиях.

Ссылки

^ П.Д. Патель и Г. Вебер, Электрофорез в свободной жидкости: обзор технологий и агропродовольственных приложений, J. Biol. Физ. хим. 2003, 3, 60–73.
^ Электрофорез в свободном потоке, Курт Ханниг и Ганс Г. Хайдрих, GIT Verlag 1990, ISBN 3-921956-88-9
^ Электрофорез в космосе - 1985, PDF.
^ С. Езерски, Л. Гитлин, С. Нагл, Д. Белдер, Многоэтапная жидкофазная литография для быстрого прототипирования микрофлюидных чипов для свободноточного электрофореза, Anal. Биоанал. хим., 2011, 401, 2651-2656.
^ «Принцип разделения FFE» . Архивировано из оригинала 1 декабря 2014 г. Проверено 4 июня 2013 г.
^ «Применение электрофореза в свободном потоке» . Архивировано из оригинала 16 ноября 2018 г. Проверено 21 января 2019 г.
^ «Архивная копия» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 г. Проверено 12 января 2016 г. {{cite web}}: CS1 maint: архивная копия в заголовке ( ссылка )
^ Ислингер, М; Экерскорн, К; Фёлкль, А (2010). «Свободнопоточный электрофорез в протеомную эпоху: постоянно меняющаяся техника». Электрофорез . 31 (11): 1754–63. дои : 10.1002/elps.200900771 . ПМИД 20506416 . S2CID 28034848 .

Внешние ссылки

[Patel-1] П.Д. Патель и Г. Вебер, Электрофорез в свободной жидкости: обзор технологий и агропродовольственных приложений, J. Biol. Физ. хим. 2003, 3, 60–73.

[2] Электрофорез в свободном потоке, Курт Ханниг и Ганс Г. Хайдрих, GIT Verlag 1990, ISBN 3-921956-88-9

[3] Электрофорез в космосе - 1985, PDF.

[4] С. Езерски, Л. Гитлин, С. Нагл, Д. Белдер, Многоэтапная жидкофазная литография для быстрого прототипирования микрофлюидных чипов для свободноточного электрофореза, Anal. Биоанал. хим., 2011, 401, 2651-2656.

[5] «Принцип разделения FFE» . Архивировано из оригинала 1 декабря 2014 г. Проверено 4 июня 2013 г.

[6] «Применение электрофореза в свободном потоке» . Архивировано из оригинала 16 ноября 2018 г. Проверено 21 января 2019 г.

[7] «Архивная копия» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 4 марта 2016 г. Проверено 12 января 2016 г. {{cite web}}: CS1 maint: архивная копия в заголовке ( ссылка )

[8] Ислингер, М; Экерскорн, К; Фёлкль, А (2010). «Свободнопоточный электрофорез в протеомную эпоху: постоянно меняющаяся техника». Электрофорез . 31 (11): 1754–63. дои : 10.1002/elps.200900771 . ПМИД 20506416 . S2CID 28034848 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]