Хеликаза-зависимая амплификация
Хеликаза-зависимая амплификация (HDA) — это метод in vitro амплификации ДНК (подобно полимеразной цепной реакции ), который происходит при постоянной температуре.
Введение
[ редактировать ]Полимеразная цепная реакция является наиболее широко используемым методом амплификации ДНК in vitro в целях молекулярной биологии и биомедицинских исследований. [1] Этот процесс включает разделение двухцепочечной ДНК при высокой температуре на одиночные цепи (стадия денатурации, обычно достигаемая при 95–97 ° C), отжиг праймеров с одноцепочечной ДНК (стадия отжига) и копирование одноцепочечной ДНК. нитей для создания новой двухцепочечной ДНК (стадия удлинения, для которой требуется ДНК-полимераза) требует проведения реакции в термоциклере . Эти настольные машины большие, дорогие и дорогостоящие в эксплуатации и обслуживании, что ограничивает потенциальное применение амплификации ДНК в ситуациях за пределами лаборатории (например, при идентификации потенциально опасных микроорганизмов на месте исследования или в месте проведения исследования). ухода за больным). Хотя ПЦР обычно связана с термоциклированием, оригинальный патент Mullis et al. [2] раскрыли использование хеликазы в качестве средства денатурации двухцепочечной ДНК, включая, таким образом, изотермическую амплификацию нуклеиновой кислоты. In vivo ДНК реплицируется с помощью ДНК-полимераз с различными вспомогательными белками, включая ДНК-хеликазу, которая разделяет ДНК, раскручивая двойную спираль ДНК. [3] HDA был разработан на основе этой концепции с использованием геликазы ( фермента ) для денатурации ДНК.
Методология
[ редактировать ]Нити двухцепочечной ДНК сначала разделяются ДНК-хеликазой и покрываются белками, связывающими одноцепочечную ДНК (оцДНК). На втором этапе два праймера, специфичных для последовательности, гибридизуются с каждой границей матрицы ДНК. Затем ДНК-полимеразы используются для удлинения праймеров, отожженных до матриц, с образованием двухцепочечной ДНК, а два вновь синтезированных продукта ДНК затем используются в качестве субстратов для ДНК-хеликаз, вступая в следующий раунд реакции. Таким образом, развивается одновременная цепная реакция, приводящая к экспоненциальной амплификации выбранной целевой последовательности (см. Vincent et al ., 2004). [4] для схематического изображения).
Современный прогресс, преимущества и недостатки HDA
[ редактировать ]С момента публикации своего открытия технология HDA используется для «простого, легко адаптируемого теста нуклеиновой кислоты для обнаружения Clostridium difficile ». [5] Другие применения включают быстрое обнаружение золотистого стафилококка путем амплификации и обнаружения короткой последовательности ДНК, специфичной для этой бактерии. [6] Преимущества HDA заключаются в том, что он обеспечивает быстрый метод амплификации нуклеиновой кислоты конкретной мишени при изотермической температуре, не требующий термоциклера. Однако исследователю требуется предварительная оптимизация праймеров, а иногда и буферов. Обычно оптимизация праймера и буфера тестируется и достигается с помощью ПЦР, что поднимает вопрос о необходимости дополнительных затрат на отдельную систему для проведения фактической амплификации. Несмотря на то, что HDA сводит на нет использование термоциклера и, следовательно, позволяет проводить исследования в полевых условиях, большая часть работы, необходимой для обнаружения потенциально опасных микроорганизмов, независимо от этого выполняется в исследовательских/больничных лабораториях. В настоящее время массовая диагностика на основе большого количества образцов пока не может быть достигнута с помощью HDA, тогда как реакции ПЦР, проводимые в термоциклере , который может содержать многолуночные планшеты для образцов, позволяют амплифицировать и обнаруживать намеченную ДНК-мишень максимум из 96 образцы. Стоимость приобретения реагентов для HDA также относительно высока по сравнению с реагентами для ПЦР, тем более что они поставляются в виде готового набора.
Внешние ссылки
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Сайки Р.К. и др. (1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Наука . 239 (4839): 487–491. дои : 10.1126/science.239.4839.487 . ПМИД 2448875 .
- ^ США 4683195
- ^ Корнберг А., Бейкер Т. (1992). Репликация ДНК, 2-е изд . WH Freeman and Company: Нью-Йорк. ISBN 978-1-891389-44-3 .
- ^ Винсент М., Сюй Ю, Конг Х (2004). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК» . Представитель ЭМБО . 5 (8): 795–800. дои : 10.1038/sj.embor.7400200 . ПМЦ 1249482 . ПМИД 15247927 .
- ^ Чоу В.Х., Макклоски С., Тонг Ю., Ху Л., Ю К., Келли С.П., Конг Х., Тан Ю.В., Тан В. (2008). «Применение изотермической геликазозависимой амплификации с помощью одноразового устройства обнаружения в простом чувствительном тесте кала на токсигенную Clostridium difficile» . Дж Мол Диагн . 10 (5): 452–8. дои : 10.2353/jmoldx.2008.080008 . ПМК 2518740 . ПМИД 18669881 .
- ^ «Набор для быстрого обнаружения стафилококка IsoAmp (описание продукта)» . Компания «Биогеликс» Архивировано из оригинала 10 октября 2009 г.