Твердое секвенирование ABI
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( январь 2010 г. ) |
SOLiD (Секвенирование путем лигирования и обнаружения олигонуклеотидов) — это технология секвенирования ДНК нового поколения, разработанная Life Technologies и коммерчески доступная с 2006 года. Эта технология следующего поколения генерирует 10 8 - 10 9 небольшая последовательность считывается за один раз. Он использует 2-х базовую кодировку для декодирования необработанных данных, сгенерированных платформой секвенирования, в данные последовательности.
Этот метод не следует путать с «секвенированием путем синтеза», принципом, используемым пиросеквенированием Roche-454 (введенным в 2005 году, генерирующим миллионы считываний размером 200-400 пар оснований в 2009 году) и системой Solexa (теперь принадлежащей Illumina) (представленной в 2006 г., в 2009 г. были произведены сотни миллионов чтений размером 50–100 п.н.)
Эти методы позволили снизить стоимость с 0,01 доллара США за базу в 2004 году до почти 0,0001 доллара США за основу в 2006 году и увеличить производительность секвенирования с 1 000 000 оснований на машину в день в 2004 году до более чем 5 000 000 000 оснований на машину в день в 2009 году. Существует более 30 публикаций, описывающих его использование впервые для позиционирования нуклеосом было предложено Валуевым и др., [1] транскрипционное профилирование или чувствительный к цепи RNA-Seq с Cloonan et al., [2] транскрипционное профилирование отдельных клеток с помощью Tang et al. [3] и, в конечном итоге, повторное секвенирование человека с помощью McKernan et al. [4]
Сообщается, что метод, используемый этой машиной (секвенирование путем лигирования), имеет некоторые проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей. [5]
Химия
[ редактировать ]Библиотеку фрагментов ДНК готовят из образца, подлежащего секвенированию, и используют для приготовления популяций клональных шариков. То есть на поверхности каждого магнитного шарика будет присутствовать только один вид фрагментов. Фрагменты, прикрепленные к магнитным шарикам, будут иметь прикрепленную универсальную адаптерную последовательность P1, так что начальная последовательность каждого фрагмента будет известна и идентична. Эмульсионная ПЦР проходит в микрореакторах, содержащих все необходимые реагенты для ПЦР. Гранулы с полученными продуктами ПЦР наносят на предметное стекло.
Праймеры гибридизуются с адаптерной последовательностью P1 в шаблоне библиотеки. Набор из четырех флуоресцентно меченных двухосновных зондов конкурирует за лигирование с праймером для секвенирования. Специфичность двухосновного зонда достигается путем опроса каждого 1-го и 2-го основания в каждой реакции лигирования. Выполняются несколько циклов лигирования, обнаружения и расщепления, количество циклов определяет конечную длину считывания. После серии циклов лигирования продукт удлинения удаляется, а матрица восстанавливается с помощью праймера, комплементарного положению n-1, для второго раунда циклов лигирования.
Для каждой метки последовательности выполняются пять раундов сброса праймера. В процессе сброса праймера каждое основание подвергается двум независимым реакциям лигирования с помощью двух разных праймеров. Например, основание в позиции считывания 5 анализируется с помощью праймера номер 2 в цикле лигирования 2 и с помощью праймера номер 3 в цикле лигирования 1.
Пропускная способность и точность
[ редактировать ]По данным ABI, платформа SOLiD 3plus предоставляет 60 гигабаз полезных данных ДНК за один прогон. Благодаря двухбазовой системе кодирования в технологию встроена встроенная проверка точности, обеспечивающая точность 99,94%. Химический состав систем также означает, что гомополимеры не препятствуют этому, в отличие от системы Roche 454 FLX, и поэтому большие и сложные повторяющиеся области гомополимера больше не являются проблемой для секвенирования.
Приложения
[ редактировать ]Естественно, эта технология будет использоваться для секвенирования ДНК, но из-за высокой параллельности всех технологий следующего поколения они также найдут применение в транскриптомике и эпигеномике .
В последние десять лет микрочипы были основой транскриптомики, а технология, основанная на микрочипах, впоследствии распространилась и на другие области. Однако они ограничены тем, что можно получить только информацию о зондах, находящихся на чипе. Можно получить информацию только об организмах, для которых доступны чипы, и они сопряжены со всеми проблемами гибридизации большого количества молекул (различные температуры гибридизации). Транскриптомика RNA-Seq с помощью секвенирования следующего поколения будет означать, что эти барьеры больше не действуют. Весь транскриптом любого организма потенциально может быть секвенирован за один проход (для очень маленьких бактериальных геномов), и будет доступна не только идентификация каждого транскрипта, но и профилирование экспрессии, поскольку также может быть достигнуто количественное считывание.
Иммунопреципитация хроматина (ChIP) — это метод определения сайтов связывания транскрипционных факторов и взаимодействий ДНК-белок. В прошлом ее с некоторым успехом комбинировали с матричной технологией (ЧИП-чип). В этой области также можно применить секвенирование следующего поколения. Иммунопреципитация метилирования (MeDIP) также может быть выполнена, а также на матрицах.
Возможность узнать больше о сайтах метилирования и связывания ТФ в масштабе всего генома является ценным ресурсом и может многому научить нас о болезнях и молекулярной биологии в целом.
См. также
[ редактировать ]- 2 Базовая кодировка
- Секвенирование нового поколения
- Прикладные биосистемы
- Иллюмина (компания)
- 454 Науки о жизни
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Валуев А., Итикава Дж., Тонхат Т. и др. (июль 2008 г.). «Карта положения нуклеосом C. elegans с высоким разрешением показывает отсутствие универсального позиционирования, диктуемого последовательностью» . Геномные исследования . 18 (7): 1051–63. дои : 10.1101/гр.076463.108 . ПМЦ 2493394 . ПМИД 18477713 .
- ^ Клунан Н., Форрест А.Р., Колле Г. и др. (июль 2008 г.). «Профилирование транскриптома стволовых клеток с помощью массового секвенирования мРНК». Природные методы . 5 (7): 613–9. дои : 10.1038/nmeth.1223 . ПМИД 18516046 . S2CID 19790151 .
- ^ Тан Ф., Барбачору С., Ван Ю. и др. (май 2009 г.). «Анализ всего транскриптома мРНК-Seq одной клетки». Природные методы . 6 (5): 377–82. дои : 10.1038/nmeth.1315 . ПМИД 19349980 . S2CID 16570747 .
- ^ МакКернан К.Дж., Пекхэм Х.Э., Коста Г.Л. и др. (сентябрь 2009 г.). «Последовательность и структурные вариации в геноме человека, обнаруженные с помощью короткого массового параллельного секвенирования лигирования с использованием двухосновного кодирования» . Геномные исследования . 19 (9): 1527–41. дои : 10.1101/гр.091868.109 . ПМЦ 2752135 . ПМИД 19546169 .
- ^ Ю-Фэн Хуан ; Шэн-Чунг Чен ; Йи-Шиен Чан и Цзы-Хань Чен (2012). «Палиндромная последовательность препятствует механизму секвенирования путем лигирования» . Системная биология BMC . 6 (Дополнение 2): S10. дои : 10.1186/1752-0509-6-S2-S10 . ПМК 3521181 . ПМИД 23281822 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Мардис ЭР (2008). «Методы секвенирования ДНК нового поколения». Ежегодный обзор геномики и генетики человека . 9 : 387–402. дои : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164359 . ПМИД 18576944 .
- Мардис ЭР (2009). «Новые стратегии и новые технологии массового параллельного секвенирования: применение в медицинских исследованиях» . Геномная медицина . 1 (4): 40. дои : 10,1186/гм40 . ПМЦ 2684661 . ПМИД 19435481 .