Микрофлуориметрия
Микрофлуориметрия — это адаптация флуориметрии для изучения биохимических и биофизических свойств клеток с помощью микроскопии для получения изображений компонентов клеток, меченных флуоресцентными молекулами. Это тип микрофотометрии , который дает количественную оценку качественного характера флуоресцентных измерений и, следовательно, позволяет получить окончательные результаты, которые ранее были неразличимы невооруженным глазом. [ 1 ]
Использование
[ редактировать ]Микрофлуориметрия применяется во многих различных областях, включая клеточную биологию , микробиологию , иммунологию , анализ клеточного цикла и «проточное кариотипирование » клеток. [ 2 ] При проточном каротипировании изолированные метафазные хромосомы окрашивают и измеряют в проточном микрофлуориметре. Флуоресцентное окрашивание хромосом также может дать распределение относительной частоты встречаемости и содержания хромосомной ДНК в измеренных хромосомах. Этот метод позволяет осуществлять кариотипирование на более высоких скоростях, чем предыдущие методы, и его точность была доказана при использовании хромосом китайского хомячка. [ 3 ] Проточная микрофлуориметрия (FMF) также может использоваться для определения различных популяций клеток с использованием флуоресцентных маркеров с небольшими образцами клеток. Маркеры, используемые для измерений в проточной микрофлуориметрии, состоят из флуоресцентных антигенов или ДНК-связывающих агентов. [ 2 ] Это позволяет точно измерить реакцию антитела с антигеном. [ 1 ] Проточная микрофлуориметрия также используется в фармацевтических исследованиях для определения типа клеток, экспрессии белков и ДНК, клеточного цикла и других свойств клеток во время лечения лекарствами. [ 4 ] Например, микрофлуориметрия используется в нейронах для сравнения влияния нейротоксинов как на концентрацию ионов кальция, так и на потенциал митохондриальной мембраны в отдельных клетках. [ 5 ] Микрофлуориметрию также можно использовать как метод отличия различных микроорганизмов друг от друга путем анализа и сравнения содержания ДНК в каждой клетке. [ 6 ] Эту же концепцию можно также применить для различения типов клеток с использованием подходящего флуоресцентного красителя, который варьируется в зависимости от цели и является важным методом в современной клеточной биологии и геномике. [ 7 ]
Еще одним применением микрофлуорометрии является проточная цитометрия , в которой используется излучение молекул флуорохрома и обычно лазер в качестве источника света для создания данных о частицах и клетках. [ 8 ] Его можно использовать для разделения хромосом с очень высокой скоростью, а также легко использовать при секвенировании следующего поколения. Этот метод может просто привести к очень быстрому разделению только соответствующих хромосом. [ 9 ] Например, бактериофаги лямбда и Т4 E. coli удалось разделить с помощью проточной цитометрии, что позволило провести геномный анализ, который ранее был затруднен. [ 10 ]
Концепция
[ редактировать ]Микрофлуориметрия основана на общепринятом методе флуориметрических измерений. Используя краситель, который флуоресцирует в присутствии целевого соединения, флуориметрия может обнаружить присутствие соединения, определяя наличие и интенсивность флуоресценции. Различия в интенсивности можно использовать для определения концентрации соединения. Кроме того, если краситель претерпевает спектральный сдвиг, вы можете определить абсолютную концентрацию мишени независимо от знания концентрации красителя. Fura-2 — пример флуоресцентного красителя, используемого для измерения кальция. Микрофлуориметрия расширяет флуориметрию, добавляя к измерениям микроскопический компонент, позволяющий анализировать отдельные клетки и другие области микроскопии. [ 11 ]
Микрофлюорометр
[ редактировать ]Микрофлуориметр представляет собой флуоресцентный спектрофотометр, совмещенный с микроскопом, предназначенный для измерения спектров флуоресценции микроскопических образцов или участков или может быть сконфигурирован для измерения спектров пропускания и отражения микроскопических участков образца. Это может быть либо полноценный микрофлуориметр, предназначенный исключительно для флуоресцентной микроспектроскопии, либо блок флуоресцентного спектрометра, который присоединяется к оптическому порту микроскопа. [ 12 ] Микрофлуориметр можно использовать для оценки количества и распределения химических компонентов в отдельных клетках или хромосомах. Чтобы оценить количество химических компонентов, интенсивность их флуоресценции измеряют методом фотоэлектрической фотометрии, а распределение находят путем измерения интенсивностей фотографий метафазных пластинок отрицательных хромосом. [ 13 ] Микроспектрофотометр может измерять спектры пропускания, поглощения, отражения и излучения, а затем с помощью встроенных алгоритмов создаются спектры, которые можно сравнить с предыдущими данными, чтобы определить состав, концентрацию и т. д. [ 12 ]
Ограничения
[ редактировать ]В этом процессе существует множество источников ошибок, но биологические ошибки, такие как невозможность подготовить однородные образцы, с большей вероятностью станут ограничением, чем технические ошибки. [ 1 ]
См. также
[ редактировать ]- Флуоресцентная спектроскопия для полного обсуждения флуоресцентных измерений.
- Флуорометр , для более полного описания приборов для флуоресцентных измерений.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Гольдман, Моррис (1971). «Микрофлуориметрия в антигенном анализе близкородственных микроорганизмов». Анналы Нью-Йоркской академии наук . 177 (1): 439–45. Бибкод : 1971NYASA.177..439G . дои : 10.1111/j.1749-6632.1971.tb35073.x . ПМИД 4333753 . S2CID 42391664 .
- ^ Перейти обратно: а б Маккензи, Нью-Мексико; Пиндер, AC (1986). «Применение проточной микрофлуориметрии (FMF) для биомедицинских исследований и диагностики: обзор». Развитие биологической стандартизации . 64 : 181–93. ПМИД 3792646 .
- ^ Грей Дж.В., Каррано А.В., Мур Д.Х., Стейнмец Л.Л., Минклер Дж., Мэйалл Б.Х., Мендельсон М.Л., Ван Дилла М.А. (август 1975 г.). «Высокоскоростное количественное кариотипирование методом проточной микрофлюорометрии» . Клиническая химия . 21 (9): 1258–62. дои : 10.1093/клинчем/21.9.1258 . ПМИД 1170959 .
- ^ Сигел, Э.Б. (сентябрь 1984 г.). «Применение проточной микрофлуорометрии для фармацевтических испытаний». Нормативная токсикология и фармакология . 4 (3): 287–304. дои : 10.1016/0273-2300(84)90028-X . ПМИД 6208577 .
- ^ Лимке, ТЛ; Атчисон, штат Вашингтон (ноябрь 2009 г.). «Применение одноклеточной микрофлуориметрии к нейротоксикологическим анализам» . Современные протоколы в токсикологии . 42 (1): 12.15.1–13. дои : 10.1002/0471140856.tx1215s42 . ISBN 978-0471140856 . ПМК 3201743 . ПМИД 20960422 .
- ^ Коулсон, П.Б.; Тиндалл, Р. (1978). «Количественное определение общей клеточной ДНК акантамебы с помощью проточной микрофлуорометрии» . Журнал гистохимии и цитохимии . 26 (9): 713–718. дои : 10.1177/26.9.361883 . ПМИД 361883 .
- ^ Лайдон, MJ; Килер, К.Д.; Томас, Д.Б. (февраль 1980 г.). «Окрашивание жизненно важной ДНК и сортировка клеток методом проточной микрофлуорометрии». Журнал клеточной физиологии . 102 (2): 175–81. дои : 10.1002/jcp.1041020208 . ПМИД 6154714 . S2CID 31003464 .
- ^ «Основы проточной цитометрии» . Архивировано из оригинала 20 сентября 2013 года . Проверено 17 ноября 2012 г.
{{cite web}}: CS1 maint: неподходящий URL ( ссылка ) - ^ Долезель, Дж; Кроу, Дж; Сафар, Дж; Бартош, Дж; Кубалакова, М; Симкова, Х. (август 2012 г.). «Хромосомы в потоке для упрощения анализа генома» . Функциональная и интегративная геномика . 12 (3): 397–416. дои : 10.1007/s10142-012-0293-0 . ПМЦ 3431466 . ПМИД 22895700 .
- ^ Аллен, LZ; Ишои, Т; Новотный, М.А.; Маклин, Дж. С.; Ласкен, РС; Уильямсон, SJ (23 марта 2011 г.). Вартанян, Жан-Пьер (ред.). «Геномика одиночного вируса: новый инструмент для обнаружения вирусов» . ПЛОС ОДИН . 6 (3): e17722. Бибкод : 2011PLoSO...617722A . дои : 10.1371/journal.pone.0017722 . ПМК 3059205 . ПМИД 21436882 .
- ^ Смиф, Пит. «Микрофлуориметрия» . Проверено 26 октября 2012 г.
- ^ Перейти обратно: а б «Микроспектрофотометр» . microspectra.com . Крейк Технологии . Проверено 25 октября 2012 г.
- ^ Barskiĭ, IIa; Ioffe, VA; Kudriavtsev, BN; Papaian, GV; Rozanov, IuM (1983). "Microfluorimeter for chromosome study". Tsitologiia . 25 (6): 711–8. PMID 6351388 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- http://microspectra.com/comComponent/content/article/52-craictech/81-микрофлюорометр , Микрофлюорометр
- https://www.youtube.com/watch?v=_lmkEqTHj3Y , Видеообъяснение применения микрофлуориметрии.
- http://www5.pbrc.hawaii.edu/bln/ian/imaged_microfluorimetry.html , Показания микрофлуориметрии