Пятно Лейшмана

Окраска Лейшмана , также известная как окраска Лейшмана , используется в микроскопии для окрашивания мазков крови . Обычно его используют для дифференциации и идентификации лейкоцитов , малярийных паразитов и трипаносом . Он основан на метанольной смеси «полихромированного» метиленового синего (т.е. деметилированного в различные азуры) и эозина . Метанольный исходный раствор стабилен и также служит для прямой фиксации мазка, исключая этап предварительной фиксации. Если рабочий раствор приготовить путем разбавления водным буфером, то полученная смесь очень нестабильна и ее нельзя использовать в течение длительного времени. Пятно Лейшмана названо в честь его изобретателя, шотландского патологоанатома Уильяма Буга Лейшмана . Это версия пятна Романовского , и поэтому оно похоже на пятно Гимзы , пятно Дженнера и пятно Райта и частично заменяется ими .

Подготовка и хранение

Многие компании продают Leishman Stain в виде сухого порошка, который позже восстанавливается метанолом . ^[1] Тепло и яркий свет окисляют пятно и вызывают выпадение нерастворимых осадков, таких как метиленвиолет (Бертсена) или соли лазурно-эозината. ^[2]

Преимущества и недостатки

Преимущества

Согласно сэра Джона Вивиана Дейси « учебнику Практическая гематология »: «Среди красок Романовского, используемых сейчас, окраска Дженнера является самой простой, а окраска Гимзы — самой сложной. Окраска Лейшмана, занимающая промежуточное положение, до сих пор широко используется в рутинном окрашивании».

Протокол ВОЗ ^[3] упоминает:

Существует ряд различных комбинаций этих красителей, которые различаются по своим характеристикам окрашивания. Май-Грюнвальд-Гимза – хороший метод для рутинной работы. Окрашивание по Райту является более простым методом, в то время как окрашивание по Лейшману также является простым методом, который особенно подходит, когда окрашенный мазок крови требуется срочно или обычное окрашивание недоступно (например, ночью). Окраска Филда — это быстрое окрашивание, используемое в основном на тонких пленках от малярийных паразитов. Какой бы метод ни использовался, важно выбирать красители, которые не загрязнены другими красителями или солями металлов.

Сэр Уильям Буг Лейшман из Лондона и Карл Рейтер из Германии независимо друг от друга открыли в 1901 году то, что считается «возможно, наиболее практичной модификацией пятна Малаховского». ^[4] Они переняли лучшие аспекты красителей, разработанных Малаховским и Дженнером, т. е. использовали как полихромный метиленовый синий (случайно сделанный Романовским, получившим это название, систематически проводимый Эрнстом Малаховским еще до Романовского, и вновь открытый Бернхардом Нохтом , но неизвестный Дженнер, Мэй, Грюнвальд и многие другие, использовавшие простой метиленовый синий) и фильтрование осадка лазурного эозината из водной смеси и повторное растворение в спиртовом растворителе (мудрость Дженнера). Различия между методами Лейшмана и Рейтера заключались в следующем: Лейшман использовал метанол (как и Дженнер) и заменил эозин Y эозином B, тогда как Рейтер использовал этиловый спирт и справедливо подчеркивал важность использования абсолютно чистого растворителя. Оба метода дали устойчивое пятно и желаемый фиолетовый цвет.

Хороший контраст

Окраска Лейшмана обычно показывает ярко-фиолетовый цвет ядра и гранул нейтрофилов, для чего дифференциальный подсчет становится удобным и качество окрашивания лучше, чем красители на основе простого метиленового синего и эозина, которые не создают достаточного контраста между цитоплазмой и ядро. Поскольку Лейшман, как и другие окраски Романовского, лучше окрашивает цитоплазматические детали и гранулы, гематологи обычно отдают им предпочтение (однако о цитологах см. ниже). По сравнению с дорогими и токсичными чистыми синтетическими реагентами на основе AZure B и эозина Y, используемыми в эталонных методах ICSH, которые также не свободны от недостатка окисления и в конечном итоге дают серый тон вместо оптимального синего цвета для цитоплазмы, Leishman является дешевым вариантом. легкодоступная и простая в исполнении техника, дающая вполне приемлемый контраст. ^{[ нужна ссылка ]}

Хорошая чувствительность к малярийному паразиту.

Было документально подтверждено, что окрашивание по Лейшману более чувствительно, чем окрашивание по Филду, и так же эффективно, как и флуоресцентное окрашивание, для обнаружения малярийных паразитов. ^[5]

Недостатки

Трудность контроля молярного соотношения

Состав полихромного метиленового синего, смешанного с эозином, никогда не бывает таким хорошим, как непосредственно взвешенные и смешанные пропорции в красителях типа Гимзы. Альберт Плен в 1890 году ^[6] выяснил, что молярное соотношение основных и кислотных красителей необходимо увеличить с 2:1 до 3:1, однако со времен Дженнерса (1899 г.) использование кристаллов лазурного эозината вернуло соотношение к неудовлетворительному 2:1 и глубина цвета стала меньше. Только работа Густава Гимзы и ему подобных, которые снова вручную контролировали пропорции этих двух компонентов, вернула глубину окрашивания. Однако Гимза и другие, кто искусственно контролировал это соотношение, иногда впадали в другую крайность (большой молярный избыток Azure до соотношения 16,1), что, вероятно, было ненужным. на ICSH оптимальное соотношение составляет 6,5 к 7,3. ^[7]

нестабильность

Краситель Лейшмана, восстановленный буфером, становится очень нестабильным (в отличие от красителя Гимзы, который относительно более стабилен благодаря глицерину, или эталонных красителей ICSH, в которых используется метанол + ДМСО в соотношении 6:4 по объему) и начинает осаждаться и требует повторной фильтрации. . При отсутствии тщательного контроля поглощение воды, испарение метанола из открытого контейнера и повторная фильтрация изменяют состав и требуют частой замены, что делает этот метод расточительным. Если не фильтровать, осадок на мазке можно спутать с тромбоцитами. Важно не встряхивать бутыль с красителем перед использованием, иначе осевшие осадки будут снова суспендированы и осядут на пленках во время окрашивания, что приведет к появлению многочисленных артефактов и очень затруднит микроскопию. ^{[ нужна ссылка ]}

Цитоплазматический контраст хорош, но ядерный контраст не так хорош, как H&E

Как и все другие методы Малаховского-Романовского-Гимзы, он со временем тускнеет и не может долго стабильно храниться в архиве. Кроме того, его вышеупомянутые аналоги окрашивают ядра в темно-фиолетовый цвет, и детали ядерных особенностей не так ясны, как гематоксилен и эозин , которые поэтому предпочитают некоторые цитопатологи. Но в этом случае это дополнительный метод (поскольку он окрашивает детали цитоплазмы, гранулы и т. д. лучше, чем окрашивание H&E ). ^{[ нужна ссылка ]}

Ссылки

^ Районная лабораторная практика в тропических странах, Часть 2 Моники Чизбро, Приложение I, Подготовка реагентов и питательных сред, стр. 396
^ Районная лабораторная практика в тропических странах, Часть 2 Моника Чизбро, Раздел 8 Гематологические тесты, подраздел 8.7 Фильмы крови, стр. 322
^ Руководство по безопасности крови и клиническим технологиям по стандартным операционным процедурам в ГЕМАТОЛОГИИ. Глава 11 - Подготовка и окрашивание мазков крови (последнее обновление: 27 апреля 2006 г.). Архивировано 1 апреля 2012 г. в Wayback Machine.
^ Биотехнологическая гистохимия. 2011 февраль;86(1):7-35. Пурпурный цвет: от королевской семьи к лаборатории, с извинениями перед Малаховским. Крафтс КП, Хемпельманн Э, Олексин БЯ.
^ Индийский журнал медицинской микробиологии, (2006) 24 (1): 49-51.
^ Плен Ф (1890b) Об этиологии малярии. Берл. Клинический еженедельный информационный бюллетень 27: 292–294.
^ Эталонный метод ICSH для окрашивания пленок крови и костного мозга AZure B и эозином Y (окраска Романовского) МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОМИТЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ В ГЕМАТОЛОГИИ Статья впервые опубликована в Интернете: 12 марта 2008 г. DOI: 10.1111/j.1365-2141.1984.tb02949.x

[1] Районная лабораторная практика в тропических странах, Часть 2 Моники Чизбро, Приложение I, Подготовка реагентов и питательных сред, стр. 396

[2] Районная лабораторная практика в тропических странах, Часть 2 Моника Чизбро, Раздел 8 Гематологические тесты, подраздел 8.7 Фильмы крови, стр. 322

[3] Руководство по безопасности крови и клиническим технологиям по стандартным операционным процедурам в ГЕМАТОЛОГИИ. Глава 11 - Подготовка и окрашивание мазков крови (последнее обновление: 27 апреля 2006 г.). Архивировано 1 апреля 2012 г. в Wayback Machine.

[4] Биотехнологическая гистохимия. 2011 февраль;86(1):7-35. Пурпурный цвет: от королевской семьи к лаборатории, с извинениями перед Малаховским. Крафтс КП, Хемпельманн Э, Олексин БЯ.

[5] Индийский журнал медицинской микробиологии, (2006) 24 (1): 49-51.

[6] Плен Ф (1890b) Об этиологии малярии. Берл. Клинический еженедельный информационный бюллетень 27: 292–294.

[7] Эталонный метод ICSH для окрашивания пленок крови и костного мозга AZure B и эозином Y (окраска Романовского) МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОМИТЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ В ГЕМАТОЛОГИИ Статья впервые опубликована в Интернете: 12 марта 2008 г. DOI: 10.1111/j.1365-2141.1984.tb02949.x

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]