Коэффициент селективности
Фактор селективности — это количественная мера того, насколько эффективен антибиотик в процессе отбора генов. [ 1 ] Он измеряет способность антибиотика отбирать трансфицированные (резистентные) клетки, содержащие селектируемый маркер, при этом убивая нетрансфицированные (чувствительные) клетки, не содержащие селектируемый маркер . Коэффициент селективности выше 10 является оптимальным. Это означает, что концентрация антибиотика достаточна для уничтожения нетрансфицированных клеток, но недостаточно токсична для уничтожения трансфицированных клеток. Коэффициент селективности ниже 10 означает, что концентрация антибиотика, необходимая для селекции, слишком близка к токсичной концентрации для трансфицированных клеток. В результате выживает меньше трансфицированных клеток и больше нетрансфицированных клеток. В этом случае следует рассмотреть альтернативный антибиотик.
Расчет коэффициента селективности
[ редактировать ]В методе используется модифицированный анализ МТТ . МТТ-анализ представляет собой колориметрический анализ, используемый для оценки метаболической активности клеток. Анализ основан на восстановлении желтой соли тетразолия (МТТ) активными клетками с образованием фиолетовых кристаллов формазана, которые накапливаются в живых клетках. [ 2 ] Клетки лизируют, кристаллы растворяют, а оптическую плотность раствора анализируют на спектрофотометре как меру жизнеспособности клеток. В ситуациях, когда использование МТТ проблематично, можно рассмотреть возможность скрининга PI или Sytox Green с помощью флуоресцентного планшет-ридера. [ 3 ] Следующим шагом является создание кривой уничтожения, которая определяет идеальную концентрацию селективного антибиотика для уничтожения нетрансфицированных клеток (рис. 1А). Кривые создаются как для чувствительных, так и для резистентных клеток. Можно рассчитать полумаксимальную ингибирующую концентрацию ( IC50 ), которая характеризует эффективность антибиотика.
Коэффициент селективности рассчитывается следующим образом:
SF = IC 5 0R/IC 50 S, тогда как SF = коэффициент селективности; IC 50 = полумаксимальная ингибирующая концентрация; R = резистентные клетки; S = чувствительные клетки
Преимущества фактора селективности
[ редактировать ]Фактор селективности имеет следующие преимущества: он носит количественный характер, поэтому его можно определить численно с помощью устройства для считывания микропланшетов, он упрощает процесс создания стабильных клеточных линий (анализ может быть завершен за 3 дня), он учитывает как чувствительные, так и резистентные клетки, а также позволяет сравнивать консистенцию и качество антибиотиков разных партий, поставщиков и методов производства. [ нужна ссылка ]
Практическое использование коэффициента селективности
[ редактировать ]Фактор селективности можно использовать для создания стабильно трансфицированных клеточных линий, что является важным инструментом в разработке лекарств, биомедицинских исследованиях и изучении биологических путей. Создание клеточной линии включает трансфекцию (перенос гена в клеточную линию) и селекцию (применение селективного давления в виде антибиотика). [ 4 ] Эффективность трансфекции зависит от типа клеток, плотности клеток, вектора и метода трансфекции. Эффективность селекции зависит от способности антибиотика убивать родительские клетки, но не трансфицированные клетки. [ нужна ссылка ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Дельрю, я; Пан, Кью; Бачманска, АК; Калленс, Б.В.; Вердудт, магистр права (август 2018 г.). «Определение селекционной способности антибиотиков для селекции генов» . Биотехнологический журнал . 13 (8): e1700747. дои : 10.1002/biot.201700747 . ПМИД 29436782 .
- ^ Берридж, М.В.; Тан, А.С. (июнь 1993 г.). «Характеристика клеточного восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ): субклеточная локализация, зависимость от субстрата и участие митохондриального электронного транспорта в восстановлении МТТ». Архив биохимии и биофизики . 303 (2): 474–82. дои : 10.1006/abbi.1993.1311 . ПМИД 8390225 .
- ^ Грутжанс, С; Хассания, Б; Дельрю, я; Гуссенс, В; Верницкий, Б; Донделингер, Ю; Бертран, MJ; Крысько, Д.В.; Вуйльстеке, М; Ванденабиле, П; Ванден Берге, Т. (август 2016 г.). «Флуориметрический метод в реальном времени для одновременного определения типа и скорости гибели клеток» . Протоколы природы . 11 (8): 1444–54. дои : 10.1038/нпрот.2016.085 . ПМИД 27414760 . S2CID 30945080 .
- ^ Брильмайер, М; Беше, Ж.М.; Фальк, Миннесота; Павлита, М; Поляк, А; Борнкамм, GW (1 мая 1998 г.). «Повышение стабильной эффективности трансфекции: антиоксиданты значительно улучшают рост клонов при селекции доминантных маркеров» . Исследования нуклеиновых кислот . 26 (9): 2082–5. дои : 10.1093/нар/26.9.2082 . ПМК 147536 . ПМИД 9547263 .