Многоколоночная противоточная градиентная очистка растворителей

Многоколоночная противоточная градиентная очистка растворителей ( MCSGP ) — это форма хроматографии , которая используется для разделения или очистки биомолекул из сложных смесей. Он был разработан в Швейцарском федеральном технологическом институте Цюриха Ауманном и Морбиделли. Процесс состоит из двух-шести хроматографических колонок, которые соединены друг с другом таким образом, что по мере движения смеси через колонки соединение очищается на несколько фракций.

Обзор

Процесс MCSGP состоит из нескольких, как минимум двух, хроматографических колонок, которые переключаются в положение, противоположное направлению потока. Большинство колонок оснащены градиентным насосом для регулирования концентрации модификатора на входе в колонку. Некоторые колонны подсоединены напрямую, поэтому потоки нечистых продуктов перерабатываются внутри компании. Другие колонки закорочены, поэтому они работают в чисто пакетном режиме. Система разделена на несколько секций, каждая из которых выполняет задачи, аналогичные задачам периодической очистки. Этими задачами являются загрузка сырья, проведение градиентного элюирования, рециркуляция фракций слабоадсорбирующихся участков, фракционирование очищенного продукта, рециркуляция фракций сильноадсорбирующихся участков, очистка колонки от сильноадсорбирующихся примесей, очистка на месте и повторное уравновешивание колонки. для запуска следующего цикла очистки. Все упомянутые здесь задачи выполняются одновременно в одном подразделении. Рециркуляция нечистых побочных фракций осуществляется в противоточном движении.

Сравнение с другими методами очистки

Биомолекулы часто очищают с помощью периодической хроматографии в градиенте растворителя . Здесь применяются плавные линейные градиенты растворителя для тщательного разделения желаемого компонента и сотен примесей. Целевой продукт обычно занимает промежуточное положение между слабо и сильно поглощающими примесями. Для получения желаемого чистого продукта необходим центральный разрез. Часто препаративные смолы имеют низкую эффективность из-за сильной осевой дисперсии и медленного массопереноса . Тогда очистка за одну хроматографическую стадию невозможна. встречное движение, известное из процесса SMB Потребуется . Для крупномасштабного производства и для очень ценных молекул необходимо применять противоточное движение твердых частиц для повышения эффективности разделения, выхода и производительности очистки. Процесс MCSGP сочетает в себе оба метода: принцип противоточного SMB и метод периодического действия с градиентом растворителя.

Прерывистый режим состоит из стадий уравновешивания, загрузки, промывки, очистки и регенерации. Прерывистый режим работы позволяет использовать преимущества градиентов растворителя, но он предполагает высокий расход растворителя и низкую производительность по сравнению с непрерывными противоточными процессами. Устоявшимся процессом такого типа является метод моделирования подвижного слоя (SMB), который требует затратных на растворитель этапов уравновешивания, промывки и регенерации только один раз за операцию и обеспечивает лучшее использование смолы. Однако основными недостатками SMB являются невозможность разделения смеси на три фракции и отсутствие возможности применения градиента растворителя.В случае антител современный метод основан на периодической аффинной хроматографии (с белком A или белком G в качестве лигандов), которая способна избирательно связывать молекулы антител. В целом, методы аффинности имеют преимущество очистки биомолекул с высокими выходами и чистотой, но их недостатками являются, как правило, высокая стоимость стационарной фазы, выщелачивание лигандов и снижение очищаемости.

Процесс MCSGP может привести к чистоте и выходам, сравнимым с таковыми при очистке с использованием белка А. Вторым примером применения прототипа MCSGP является разделение трех вариантов MAb с использованием препаративной слабой катионообменной смолы. Хотя вариант MAb с промежуточным элюированием можно получить только с чистотой 80% при степени извлечения, близкой к нулю, в периодическом хроматографическом процессе, процесс MCSGP может обеспечить чистоту 90% при выходе 93%. Численное сравнение процесса MCSGP с периодическим хроматографическим процессом и периодическим хроматографическим процессом, включающим идеальную рециркуляцию, было выполнено с использованием промышленной очистки полипептидов в качестве модельной системы. Это показывает, что процесс MCSGP может повысить производительность в 10 раз и снизить потребность в растворителе на 90%.

Основными преимуществами периодической хроматографии с градиентом растворителя являются высокие выходы даже при сложных разделениях, меньший расход растворителя, более высокая производительность, использование противоточного движения твердых частиц, что повышает эффективность разделения. Процесс непрерывен. Как только достигается устойчивое состояние, он обеспечивает непрерывно очищенный продукт постоянного качества и количества. Встроена автоматическая очистка на месте. Возможен чисто эмпирический расчет рабочих условий на основе хроматограммы периодического действия с градиентом растворителя.

Приложения

Все хроматографические очистки и разделения, которые выполняются с помощью периодической хроматографии в градиенте растворителя, могут быть выполнены с использованием MCSGP. Типичными примерами являются обращенно-фазовая очистка пептидов , хроматография гидрофобного взаимодействия жирных кислот или, например, хроматография белков ионообменная или антител . Этот процесс позволяет эффективно обогащать компоненты, которые подавались лишь в небольших количествах. Непрерывный захват антител без аффинной хроматографии можно реализовать с помощью процесса MCSGP.