Абсолютная молярная масса

Абсолютная молярная масса — это процесс, используемый для определения характеристик молекул .

История

Первые абсолютные измерения молекулярных масс (т.е. сделанные без ссылки на стандарты) были основаны на фундаментальных физических характеристиках и их отношении к молярной массе. Наиболее полезными из них были мембранная осмометрия и седиментация .

Другой абсолютный инструментальный подход стал возможен также с развитием рассеяния света теории Альбертом Эйнштейном , Чандрасекхарой Венката Раманом , Питером Дебаем , Бруно Х. Зиммом и другими. Проблема с измерениями, выполненными с помощью мембранной осмометрии и седиментации, заключалась в том, что они характеризовали только объемные свойства образца полимера . Более того, измерения отнимали слишком много времени и были подвержены ошибкам оператора . Для получения информации о полидисперсной смеси молярных масс был разработан метод разделения различных размеров. Это было достигнуто с появлением эксклюзионной хроматографии (SEC). ЭХ основана на том факте, что поры в насадочном материале хроматографических колонок можно сделать достаточно маленькими, чтобы молекулы могли временно задерживаться в их межузельном пространстве. По мере того, как образец проходит через колонку, более мелкие молекулы проводят больше времени, путешествуя в этих пустотах, чем более крупные, у которых меньше мест, где можно «блуждать». В результате образец разделяется в соответствии с его гидродинамический объем $V_{h}$ . В результате в элюент первыми выходят большие молекулы, а затем за ними следуют мелкие. Выбрав подходящий материал насадки колонки, можно определить разрешающую способность системы. Колонки также можно объединять последовательно для увеличения разрешения или диапазона изучаемых размеров.

Следующим шагом является преобразование времени элюирования образцов в измерение молярной массы. Это возможно, поскольку если бы была известна молярная масса стандарта, время элюирования этого стандарта должно было бы равняться определенной молярной массе. Используя несколько стандартов, калибровочную кривую зависимости можно построить времени от молярной массы. Это важно для анализа полимеров, поскольку можно показать, что один полимер состоит из множества различных компонентов, сложность и распределение которых также будут влиять на физические свойства. Однако эта технология имеет недостатки. Например, неизвестные образцы всегда измеряются относительно известных стандартов, и эти стандарты могут иметь или не иметь сходство с интересующим образцом. Измерения, выполненные SEC, затем математически преобразуются в данные, аналогичные тем, которые получаются с помощью существующих методов.

Проблема заключалась в том, что система была откалибрована по характеристикам Vh полимерных стандартов, не связанных напрямую с молярной массой. Если соотношение между молярной массой и Vh стандарта не такое же, как у неизвестного образца, калибровка недействительна. Таким образом, чтобы быть точным, калибровка должна использовать тот же полимер, той же конформации, в том же элюенте и иметь такое же взаимодействие с растворителем, поскольку гидратный слой изменяет Vh.

Бенуа и др. показало, что учет гидродинамического объема позволит решить проблему. В своей публикации Бенуа показал, что все синтетические полимеры элюируются по одной и той же кривой, если построить график зависимости характеристической вязкости, умноженной на молярную массу, от объема элюирования. Это основа универсальной калибровки, которая требует наличия вискозиметра для измерения характеристической вязкости полимеров. Было показано, что универсальная калибровка работает для разветвленных полимеров, сополимеров, а также полимеров звездчатого типа.

Для хорошей хроматографии не должно быть никакого взаимодействия с колонкой, кроме взаимодействия, обусловленного ее размером. По мере роста требований к свойствам полимеров возрастала и необходимость получения абсолютной информации о молярной массе и размере. Это было особенно важно в фармацевтических приложениях, где небольшие изменения молярной массы (например, агрегации ) или формы могут привести к различной биологической активности . Эти изменения на самом деле могут иметь вредный эффект вместо полезного.

Чтобы получить молярную массу, приборы светорассеяния должны измерять интенсивность света, рассеянного под нулевым углом. Это непрактично, поскольку лазерный источник будет затмевать интенсивность рассеяния света под нулевым углом. Две альтернативы заключаются в измерении угла очень близкого к нулевому или измерении под многими углами и экстраполяции с использованием модели (Рэлея, Рэлея-Ганса-Дебая, Берри, Ми и т. д.) до угла нулевого градуса.

Традиционные приборы светорассеяния работали, снимая показания под разными углами, каждый из которых измерялся последовательно. В начале 1970-х годов была разработана система рассеяния света под малым углом, которая позволяла использовать одно измерение для расчета молярной массы. Хотя измерения под малыми углами лучше по фундаментальным физическим причинам (молекулы имеют тенденцию рассеивать больше света в направлениях под меньшими углами, чем под большими углами), явления рассеяния под малыми углами, вызванные пылью и загрязнением подвижной фазы, легко подавляют рассеяние интересующими молекулами. . Когда в 1970-х и середине 1980-х годов стало популярным малоугловое рассеяние лазерного света (LALLS), одноразовые фильтры хорошего качества были недоступны, и, следовательно, измерения под разными углами получили распространение.

Многоугольное рассеяние света было изобретено в середине 1980-х годов, и подобные инструменты могли проводить измерения под разными углами одновременно, но только в конце 1980-х годов (10-12). ^{[ объяснить ]} что подключение детекторов многоуглового лазерного рассеяния (MALS) к системам SEC было практическим предложением, позволяющим определять как молярную массу, так и размер каждого среза полимерной фракции.

Приложения

Измерения светорассеяния можно применять к синтетическим полимерам , белкам , фармацевтическим препаратам и частицам, таким как липосомы , мицеллы и инкапсулированные белки. Измерения можно проводить в одном из двух режимов: нефракционированном ( периодический режим) или в режиме непрерывного потока (с помощью ЭХ, ВЭЖХ или любого другого метода фракционирования потока ). Эксперименты в периодическом режиме можно проводить либо путем введения образца в проточную ячейку с помощью шприца, либо с использованием отдельных флаконов. Эти измерения чаще всего используются для измерения временных событий, таких как реакции антитело-антиген или сборка белка . Измерения в периодическом режиме также можно использовать для определения второго вириального коэффициента (A2), значения, которое дает меру вероятности кристаллизации или агрегации в данном растворителе. Эксперименты с непрерывным потоком можно использовать для изучения материала, элюируемого практически из любого источника. Традиционно детекторы подключаются к множеству различных систем хроматографического разделения. Возможность определения массы и размера элюируемых материалов сочетает в себе преимущества системы разделения с абсолютным измерением массы и размера элюируемых частиц.

Добавление SLS-детектора, подключенного после хроматографической системы, позволяет использовать SEC или подобное разделение в сочетании с преимуществами метода абсолютного обнаружения. Данные о светорассеянии зависят исключительно от сигнала светорассеяния, умноженного на концентрацию; время элюирования не имеет значения, и разделение можно изменить для разных образцов без повторной калибровки. Кроме того, также можно использовать метод разделения по размеру, такой как ВЭЖХ или ИК.Поскольку детектор светорассеяния зависит от массы, он становится более чувствительным по мере увеличения молярной массы. Таким образом, это отличный инструмент для обнаружения агрегации. Чем выше число агрегации, тем более чувствительным становится детектор.

Метод малоуглового (лазерного) рассеяния света (ЛАРС)

Измерения LALS проводятся под очень малым углом, где вектор рассеяния почти равен нулю. LALS не нуждается в какой-либо модели для определения угловой зависимости и, следовательно, дает более надежные измерения молекулярной массы больших молекул. Сама по себе LALS не дает никаких указаний на среднеквадратичный радиус.

Метод многоуглового (лазерного) рассеяния света (MALS)

Измерения MALS основаны на расчете количества света, рассеянного под каждым обнаруженным углом. Расчет основан на измеренной интенсивности света и квантовой эффективности каждого детектора. Затем используется модель для аппроксимации интенсивности света, рассеянного под нулевым углом. Рассеянный под нулевым углом свет затем соотносится с молярной массой.

Как отмечалось ранее, детектор MALS также может предоставить информацию о размере молекулы. Эта информация представляет собой среднеквадратичный радиус молекулы (RMS или Rg). Это отличается от упомянутого выше Rh, который учитывает гидратный слой. Чисто математический среднеквадратичный радиус определяется как радиусы, составляющие молекулу, умноженные на массу этого радиуса.

Библиография

А. Эйнштейн , Энн. Физ. 33 (1910), 1275
CV Raman, Indian J. Phys. 2 (1927), 1
П.Дебай, Дж. Прикл. Физ. 15 (1944), 338
BH Zimm, J. Chem. Физ. 13 (1945), 141
BH Zimm, J. Chem. Физ. 16 (1948), 1093
Б. Х. Зимм, Р. С. Штейн и П. Дотти, Pol. Бык. 1,(1945), 90
М. Фиксман, J. Chem. Физ. 23 (1955), 2074 г.
AC Ouano и W. Kaye J. Poly. наук. А1(12) (1974), 1151
З. Грубишич, П. Ремпп и Х. Бенуа, J. Polym. наук, 5 (1967), 753.
Проточный детектор MALS, DLS 800, Science Spectrum Inc.
П. Дж. Вятт, К. Джексон и Г. К. Вятт Ам. Лаборатория 20(6) (1988), 86
П. Дж. Вятт, Д. Л. Хикс, К. Джексон и Г. К. Вятт Ам. Лаб. 20(6) (1988), 106
К. Джексон, Л.М. Нильссон и П.Дж. Вятт Дж. Аппл. Поли. наук. 43 (1989), 99