Лигазная цепная реакция
Лигазная цепная реакция ( ЛЦР ) – это метод амплификации ДНК . Лигазная цепная реакция (ЛЦР) представляет собой процесс амплификации, который отличается от ПЦР тем, что он включает в себя термостабильную лигазу для соединения двух зондов или других молекул вместе, которые затем можно амплифицировать с помощью стандартной циклической полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Barany, 1991). Каждый цикл приводит к удвоению молекулы целевой нуклеиновой кислоты. Ключевым преимуществом LCR является большая специфичность по сравнению с PCR. [ 1 ] Таким образом, для правильной работы LCR необходимы два совершенно разных фермента: лигаза для соединения молекул зонда вместе и термостабильная полимераза (например, Taq -полимераза) для амплификации молекул, участвующих в успешном лигировании. Зонды, участвующие в лигировании, сконструированы таким образом, что 5'-конец одного зонда непосредственно примыкает к 3'-концу другого зонда, тем самым обеспечивая необходимые субстраты групп 3'-OH и 5'-PO4 для лигазы.
LCR изначально был разработан для обнаружения точковых мутаций; единственное несовпадение оснований на стыке двух молекул-зондов — это все, что необходимо для предотвращения лигирования. При выполнении лигирования прямо в точке Tm олигонуклеотидного зонда будут допускаться только идеально подобранные дуплексы праймер:матрица. LCR также можно использовать для амплификации молекул матрицы, которые были успешно лигированы, с целью оценки эффективности лигирования и получения большого количества продукта с еще большей специфичностью, чем ПЦР. Таким образом, LCR не обязательно является альтернативой, а скорее дополнением ПЦР.
Целевые условия
[ редактировать ]Он широко использовался для обнаружения мутаций одного основания , например, при генетических заболеваниях . [ 2 ]
LCR и PCR могут использоваться для обнаружения гонореи и хламидиоза и могут выполняться на образцах мочи первого сбора , что обеспечивает легкий сбор и большой выход микроорганизмов. Эндогенные ингибиторы ограничивают чувствительность , но если бы этот эффект можно было устранить, ЛЦР и ПЦР имели бы клинические преимущества перед любыми другими методами диагностики гонореи и хламидиоза. [ 3 ] Среди этих методов LCR становится наиболее чувствительным методом с высокой специфичностью для обнаружения известного однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (20). LCR был впервые разработан Барани, который использовал термостабильную ДНК-лигазу для различения нормальной и мутантной ДНК и для амплификации аллель-специфического продукта. Несоответствие на 3'-конце различающего праймера не позволяет ДНК-лигазе соединить два фрагмента вместе. Используя обе цепи геномной ДНК в качестве мишеней для гибридизации олигонуклеотидов, продукты, полученные из двух наборов соседних олигонуклеотидных праймеров, комплементарных каждой целевой цепи в одном раунде лигирования, могут стать мишенями для следующего раунда. Таким образом, количество продуктов может быть увеличено в геометрической прогрессии путем повторного термоциклирования.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Видманн, М; Уилсон, WJ; Чайка, Дж; Луо, Дж; Барани, Ф; Батт, Калифорния (февраль 1994 г.). «Лигазная цепная реакция (ЛЦР) – обзор и применение» . Методы и приложения ПЦР . 3 (4): С51–64. дои : 10.1101/gr.3.4.s51 . ПМИД 8173509 .
- ^ Барани, Ф. (январь 1991 г.). «Обнаружение генетических заболеваний и амплификация ДНК с использованием клонированной термостабильной лигазы» . Proc Natl Acad Sci США . 88 (1): 189–93. Бибкод : 1991PNAS...88..189B . дои : 10.1073/pnas.88.1.189 . ПМК 50775 . ПМИД 1986365 .
- ^ Грегори, Дж. Слесарь, доктор медицинских наук. (1997). «Новые диагностические тесты на гонорею и хламидиоз». Обновление первичной медицинской помощи для акушеров-гинекологов . 4 (5): 161–167. дои : 10.1016/S1068-607X(97)00044-9 .
Общее чтение
[ редактировать ]- Уокер Дж. М. и Рэпли Р. (2005). Справочник по медицинским биометодам. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. ISBN 978-1-59259-870-0