Ярлык соответствия

Аффинные метки представляют собой класс ингибиторов ферментов , которые ковалентно связываются со своей мишенью, вызывая ее инактивацию. Отличительной чертой аффинной метки является использование нацеливающей группы для специфичной и обратимой доставки слабореактивной группы к ферменту, которая необратимо связывается с аминокислотным остатком. Нацеливающая часть метки часто напоминает природный субстрат фермента, поэтому перед ковалентной связью используется аналогичный способ нековалентного связывания. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Их полезность в медицине может быть ограничена специфичностью первого этапа нековалентного связывания, тогда как неизбирательное действие может использоваться для таких целей, как аффинное мечение - метод проверки субстрат-специфического связывания соединений. ^{[ 1 ]}

Эти метки не ограничиваются ферментами, но также могут быть предназначены для взаимодействия с антителами или рибозимами , хотя такое использование встречается реже. Хотя такие белки, как гемоглобин, не имеют активного центра, карманы связывания можно использовать для определения их сродства и, таким образом, помечать.

Классификации

Метки сходства можно разделить на три отдельные категории в зависимости от их реактивных групп и способа доставки. ^{[ 3 ]}

Классические метки сходства

Эта категория включает в себя простейший подход связывания электрофила с низкой собственной реакционной способностью с нековалентным связывающим фрагментом, который часто имитирует природный субстрат. Ключом к этому обозначению является то, что реакционная способность электрофила не изменяется под действием фермента и что нековалентная связывающая часть служит для увеличения присутствия и времени жизни электрофила в активном центре ( эффективная молярность ). Слабореакционноспособная группа может реагировать с функциональными группами вне активного центра или на других белках, но селективность обеспечивается нековалентным связывающим фрагментом. Кинетические признаки этого типа ингибитора можно обнаружить при насыщении, поскольку ковалентная реакция (кинакт) становится стадией, лимитирующей скорость при высоких концентрациях ингибитора. Благодаря этому подходу несколько препаратов, таких как афатиниб, получили одобрение FDA. Также был изучен обратный подход: использование слабонуклеофильного ингибитора для атаки связанного с белком электрофила. Этот подход получил гораздо меньше внимания из-за отсутствия электрофилов белка и только тех, у кого есть подходящие кофакторы могут быть целевыми. ^{[ 1 ]}^{[ 3 ]}

Неактивные метки сходства

Покоящиеся аффинные метки представляют собой многообещающий подход к ингибированию ферментов с использованием «замаскированных» реактивных функциональных групп, которые обнаруживаются только в активном центре. Этот подход отличается от инактиваторов, основанных на механизме, тем, что катализ должен быть «вне пути». Одним из лучших примеров, объясняющих эту форму катализа, является инактивация диметиларгиндиметиламиногидролазы (DDAH) 4-галогенпиридинами. При физиологическом pH группа 4-галоген имеет практически незначительную реакционную способность по отношению к тиолатам, но при протонировании азота реакционная способность увеличивается примерно в 4500 раз. Это протонирование происходит вне пути за счет остатка аспартата, который обычно не участвует в катализе. После атаки цистеина активного центра и потери галогенида фермент необратимо модифицируется. Это требование катализа регулирует селективность модификации. ^{[ 3 ]} Этот класс не ограничивается галогенпиридинами, и использовались функциональные группы, включая эпоксиды и пептидилацилоксиметилкетоны. Кинетическая подпись этого класса напоминает классические метки сродства. Этот термин ранее использовался для описания аффинных меток, которые содержат слабореактивные группы, но в недавней литературе появилась необходимость катализа вне пути. ^{[ 4 ]}

Ярлыки фотоаффинности

Фотоаффинные метки характеризуются неферментативной реактивностью, вызываемой воздействием света, и нековалентным нацеливающим фрагментом, повышающим эффективную молярность этой реактивной группы в активном центре. Хотя этот метод теоретически кажется обоснованным, часто наблюдается низкая степень мечения, главным образом из-за гашения реактивных частиц растворителем или другими веществами в растворе. Однако такое гашение может быть выгодным, поскольку это настолько быстрый процесс, что после образования реакционноспособных частиц они не будут диффундировать в сколько-нибудь заметной степени и будут реагировать только с молекулами, с которыми они непосредственно соседствуют.

Фотоаффинные метки не имеют больших перспектив для ингибирования или применения лекарств, но подходят для идентификации сайтов связывания лигандов. Реакционноспособные группы, такие как нитрены или 2-арил-5-карбокситетразолы, часто используются для получения высокореакционноспособных, неселективных карбенов или умеренно селективных нитрилиминных промежуточных продуктов соответственно. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}

Использование маркировки сходства

При характеристике фермента важно идентифицировать аминокислотные остатки, ответственные за катализ. Хотя ясно, что рентгеновская кристаллография предоставит более подробную трехмерную информацию об активном сайте, возвращается только статическая картина, и могут возникнуть трудности с совместной кристаллизацией субстрата или имитаторов из-за ферментативного оборота.

Классическим примером использования аффинных меток для этой цели является картирование топографии активного центра химотрипсина. Благодаря использованию трех различных аффинных меток, которые помещали реакционноспособные группы (галогенметилкетоны или фосфофториды) в разные области ядра природного субстрата, можно было определить относительные положения и идентичность трех разных аминокислот. ^{[ 1 ]} Еще одним ярким примером использования аффинной маркировки для определения активного центра фермента является работа Грачева с соавт. что привело к характеристике β-субъединицы коровой РНК-полимеразы как субъединицы, ответственной за образование фосфодиэфирной связи в процессе прокариотической транскрипции. ^{[ 5 ]}

Профилирование белков на основе активности (ABPP)

Основной единицей протеомики, основанной на активности, является зонд, который обычно состоит из двух элементов: реактивной группы (РГ, иногда называемой «боеголовкой») и метки. Кроме того, некоторые зонды могут содержать связывающую группу, повышающую селективность. Реакционная группа обычно содержит специально созданный электрофил, который ковалентно связывается с нуклеофильным остатком в активном центре активного фермента. Фермент, который ингибируется или посттрансляционно модифицируется, не будет реагировать с зондом, основанным на активности. Метка может представлять собой либо репортер, такой как флуорофор, либо аффинную метку, такую как биотин, или алкин или азид для использования с 1,3-диполярным циклоприсоединением Хейсгена (также известным как клик-химия).

См. также

Суицидальное торможение

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Вофси Л., Мецгер Х., Сингер С.Дж. (ноябрь 1962 г.). «Аффиное мечение - общий метод мечения активных центров молекул антител и ферментов». Биохимия . 1 : 1031–9. дои : 10.1021/bi00912a013 . ПМИД 14001461 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Колман Р.Ф. (1995). «Аффинная маркировка и соответствующие подходы к нацеливанию на определенные сайты ферментов». В Biswas BB, Рой С. (ред.). Белки: структура, функции и инженерия . Субклеточная биохимия. Том. 24. Бостон, Массачусетс: Спрингер. стр. 177–205. дои : 10.1007/978-1-4899-1727-0_7 . ISBN 978-1-4899-1729-4 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Тули А., Фаст W (июнь 2018 г.). «Таксономия ковалентных ингибиторов» . Биохимия . 57 (24): 3326–3337. doi : 10.1021/acs.biochem.8b00315 . ПМК 6016374 . ПМИД 29689165 .
^ Джонсон CM, Лински Т.В., Юн Д.В., Person MD, Fast W (февраль 2011 г.). «Открытие галопиридинов как покоящихся аффинных меток: инактивация диметиларгининдиметиламиногидролазы» . Журнал Американского химического общества . 133 (5): 1553–62. дои : 10.1021/ja109207m . ПМК 3038607 . ПМИД 21222447 .
^ Грачев М.А., Колочева Т.И., Лухтанов Е.А. и А.А. Мустаев. 1987. Исследования функциональной топографии РНК-полимеразы Escherichia coli. Высокоселективная аффинная маркировка аналоги инициирующих субстратов. Евро. Дж. Биохим. 163:113-121. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1987.tb10743.x

[Wofsy_1862-1] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Вофси Л., Мецгер Х., Сингер С.Дж. (ноябрь 1962 г.). «Аффиное мечение - общий метод мечения активных центров молекул антител и ферментов». Биохимия . 1 : 1031–9. дои : 10.1021/bi00912a013 . ПМИД 14001461 .

[Colman_1995-2] Перейти обратно: ^а ^б Колман Р.Ф. (1995). «Аффинная маркировка и соответствующие подходы к нацеливанию на определенные сайты ферментов». В Biswas BB, Рой С. (ред.). Белки: структура, функции и инженерия . Субклеточная биохимия. Том. 24. Бостон, Массачусетс: Спрингер. стр. 177–205. дои : 10.1007/978-1-4899-1727-0_7 . ISBN 978-1-4899-1729-4 .

[Tuley_2018-3] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Тули А., Фаст W (июнь 2018 г.). «Таксономия ковалентных ингибиторов» . Биохимия . 57 (24): 3326–3337. doi : 10.1021/acs.biochem.8b00315 . ПМК 6016374 . ПМИД 29689165 .

[4] Джонсон CM, Лински Т.В., Юн Д.В., Person MD, Fast W (февраль 2011 г.). «Открытие галопиридинов как покоящихся аффинных меток: инактивация диметиларгининдиметиламиногидролазы» . Журнал Американского химического общества . 133 (5): 1553–62. дои : 10.1021/ja109207m . ПМК 3038607 . ПМИД 21222447 .

[5] Грачев М.А., Колочева Т.И., Лухтанов Е.А. и А.А. Мустаев. 1987. Исследования функциональной топографии РНК-полимеразы Escherichia coli. Высокоселективная аффинная маркировка аналоги инициирующих субстратов. Евро. Дж. Биохим. 163:113-121. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1987.tb10743.x

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]