Jump to content

Колокализация

В флуоресцентной микроскопии колокализация означает наблюдение пространственного перекрытия между двумя (или более) разными флуоресцентными метками, каждая из которых имеет отдельную длину волны излучения, чтобы увидеть, расположены ли разные «мишени» в одной и той же области клетки или очень близко к ней. друг друга. Это определение можно разделить на два разных явления: совместное появление, которое относится к присутствию двух (возможно, не связанных между собой) флуорофоров в одном и том же пикселе, и корреляция, гораздо более значительная статистическая связь между флуорофорами, указывающая на биологическое взаимодействие. [1] Этот метод важен для многих клеточных биологических и физиологических исследований при демонстрации взаимоотношений между парами биомолекул.

Способность продемонстрировать корреляцию между парой биомолекул была значительно расширена Эриком Мандерсом из Амстердамского университета, который представил коэффициент корреляции Пирсона (PCC). микроскопистам [2] наряду с другими коэффициентами, наиболее популярными и полезными оказались «коэффициенты перекрытия» M1 и M2. [3] [4] Цель использования коэффициентов - охарактеризовать степень перекрытия между изображениями, обычно двумя каналами в многомерном микроскопическом изображении, записанном на разных длинах волн излучения. Популярный подход был предложен Сильвеном Костесом, который использовал коэффициент корреляции Пирсона как инструмент для объективной установки пороговых значений, требуемых M1 и M2. [5] Подход Костеса предполагает, что интерес представляют только положительные корреляции, и не обеспечивает полезного измерения PCC.

Хотя использование коэффициентов может значительно повысить надежность обнаружения колокализации, это зависит от ряда факторов, в том числе от условий подготовки образцов с флуоресценцией и способа получения и обработки изображений с колокализацией. Исследования следует проводить с большой осторожностью и после тщательного ознакомления. В настоящее время в этой области царит путаница, и стандартизированный подход еще не установлен. [6] Попытки исправить это включают пересмотр и пересмотр некоторых коэффициентов. [7] [8] применение коэффициента для коррекции шума, [1] «Корреляции с коррекцией шума на основе репликации для точных измерений колокализации». [9] и предложение дальнейших протоколов, [10] которые были тщательно рассмотрены Болте и Кордельером (2006). [6] Кроме того, из-за тенденции флуоресцентных изображений содержать определенное количество расфокусированного сигнала, пуассоновского выстрела и других шумов, они обычно требуют предварительной обработки перед количественной оценкой. [11] [12] Тщательное восстановление изображения путем деконволюции удаляет шум и увеличивает контраст изображений, улучшая качество результатов анализа колокализации. До сих пор наиболее часто используемые методы количественной оценки колокализации рассчитывают статистическую корреляцию интенсивностей пикселей в двух различных каналах микроскопии. Более поздние исследования показали, что это может привести к высоким коэффициентам корреляции даже для целей, которые, как известно, находятся в разных клеточных компартментах. [13] Более надежная количественная оценка колокализации может быть достигнута путем объединения распознавания цифровых объектов, расчета перекрытия областей и комбинации со значением корреляции интенсивности пикселей. Это привело к концепции объектно-скорректированного коэффициента корреляции Пирсона. [13]

Примеры использования

[ редактировать ]

непроницаемые флуоресцентные цинковые красители могут заметно маркировать цитозоль и ядра апоптизирующих Некоторые и некротизирующих клеток в каждом из четырех исследованных типов тканей. А именно: кора головного мозга , гиппокамп , мозжечок , а также было продемонстрировано, что колокализованное обнаружение увеличения цинка и общепринятого индикатора гибели клеток йодида пропидия также происходит в клетках почек. Использование принципов флуоресцентной колокализации. Было продемонстрировано одновременное обнаружение накопления цинка и поглощения йодида пропидия (традиционного индикатора гибели клеток) в нескольких типах клеток. [14] Различные примеры количественной оценки колокализации в области нейробиологии можно найти в обзоре. [15] Подробные протоколы количественной оценки колокализации можно найти в главе книги. [16]

Разрешение одной молекулы

[ редактировать ]

Колокализация используется во флуоресцентной микроскопии одиночных молекул в реальном времени для обнаружения взаимодействий между флуоресцентно меченными молекулярными видами. В этом случае один вид (например, молекула ДНК) обычно иммобилизуется на поверхности визуализации, а другой вид (например, ДНК-связывающий белок) подается в раствор. Оба вида помечены красителями спектрально разрешенных цветов (>50 нм), например цианином-3 и цианином-5. Возбуждение флуоресценции обычно осуществляется в режиме полного внутреннего отражения, что увеличивает отношение сигнал/шум для молекул на поверхности по сравнению с молекулами в объемном растворе. Молекулы обнаруживаются как пятна, появляющиеся на поверхности в режиме реального времени, а их местоположение определяется с точностью до 10-20 нм путем подбора функций разброса точек. Поскольку типичные размеры биомолекул составляют порядка 10 нм, такой точности обычно достаточно для определения молекулярных взаимодействий. [17]

Интерпретация результатов

[ редактировать ]

С целью лучшей интерпретации результатов качественных и количественных исследований колокализации было предложено использовать набор из пяти лингвистических переменных, привязанных к значениям коэффициентов колокализации, таких как очень слабая , слабая , умеренная , сильная и очень сильная , для их описания. Подход основан на использовании нечеткой модели системы и компьютерного моделирования. При введении новых коэффициентов их значения могут быть включены в набор. [18]

[ редактировать ]

Контрольные изображения

[ редактировать ]

Степень колокализации на изображениях флуоресцентной микроскопии можно проверить с помощью источника тестов колокализации — бесплатной коллекции загружаемых наборов изображений с заранее заданными значениями колокализации.

Реализации программного обеспечения

[ редактировать ]

открытый исходный код

[ редактировать ]
  • FIJI — это просто ImageJ — батарейки в комплекте
  • БиоИзображение XD

закрытый исходный код

[ редактировать ]
  • Модуль колокализации AxioVision
  • Программное обеспечение для исследования колокализации
  • CoLocalizer Pro CoLocalizer Pro
  • Модуль колокализации NIS-Elements от Nikon
  • Анализатор колокализации Гюйгенса от Scientific Volume Imaging
  • Volocity от Quorum Technology
  • Image-Pro от Media Cybernetics
  • В Имаре Bitplane
  • пришел Vision4D
  • [19]
  1. ^ Перейти обратно: а б Адлер и др. (2008)
  2. ^ Мандерс и др. (1992). «Динамика трехмерных моделей репликации во время S-фазы, проанализированная с помощью двойного мечения ДНК и конфокальной микроскопии». [1]
  3. ^ Мандерс; и др. (1993). «Измерение совместной локализации объектов на двухцветных конфокальных изображениях». Журнал микроскопии . 169 (3): 375–382. дои : 10.1111/j.1365-2818.1993.tb03313.x . ПМИД   33930978 . S2CID   95098323 .
  4. ^ Зинчук В и др. (2007). «Количественный анализ колокализации многоцветных изображений конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии: использование пикселей для исследования биологических явлений». Acta Histochem Cytochem 40:101-111.
  5. ^ Костес и др. (2004) «Автоматическое и количественное измерение белок-белковой колокализации в живых клетках». [2]
  6. ^ Перейти обратно: а б БОЛТЕ и КОРДЕЛЬЕР (2006) «Экскурсия по анализу субклеточной колокализации в световой микроскопии». [3]
  7. ^ Адлер и Пармрид (2010) «Количественная оценка колокализации посредством корреляции: коэффициент корреляции Пирсона превосходит коэффициент перекрытия Мандера». [4]
  8. ^ Краус и др. (2015). «Колокализация флуоресцентных и рамановских микроскопических изображений для идентификации субклеточных компартментов: проверочное исследование». Аналитик, том 140, выпуск 7, страницы 2360-2368. [5]
  9. ^ Адлер, Дж.; Пагакис, С.Н.; Пармрид, И. (1 апреля 2008 г.). «Корреляция с поправкой на шум на основе репликации для точных измерений колокализации». Журнал микроскопии . 230 (1): 121–133. дои : 10.1111/j.1365-2818.2008.01967.x . ПМИД   18387047 . S2CID   12758752 .
  10. ^ Curr Protoc Cell Biol «Количественный анализ колокализации изображений конфокальной флуоресцентной микроскопии». Архивировано 28 ноября 2009 г. в Wayback Machine.
  11. ^ Поли Дж.Б. (2006). Справочник по биологической конфокальной микроскопии
  12. ^ Зинчук В и др. (2011). «Количественная оценка пространственных корреляций флуоресцентных маркеров с использованием усиленного снижения фона с помощью оценки индекса близости белков и коэффициентов корреляции». Нат Проток 6:1554-1567.
  13. ^ Перейти обратно: а б Мозер, Бернхард; Хохрейтер, Бернхард; Хербст, Рут; Шмид, Йоханнес А. (01 июля 2016 г.). «Анализ флуоресцентной колокальной микроскопии можно улучшить, объединив распознавание объектов с корреляцией интенсивности пикселей» . Биотехнологический журнал . 12 (1): 1600332. doi : 10.1002/biot.201600332 . ISSN   1860-7314 . ПМК   5244660 . ПМИД   27420480 .
  14. ^ Сторк, Кристиан Дж.; Ли, Ян В. (15 сентября 2006 г.). «Измерение жизнеспособности клеток с помощью непроницаемого для мембран цинкового флуоресцентного индикатора». Журнал методов нейробиологии . 155 (2): 180–186. doi : 10.1016/j.jneumeth.2005.12.029 . ПМИД   16466804 . S2CID   16900662 .
  15. ^ Зинчук В. и Гроссенбахер-Зинчук О. (2009). «Последние достижения в количественном анализе колокализации: фокус на нейробиологии». Прог Гистохем Цитохем 44:125-172
  16. ^ «Адлер Дж. и Пармрид I (2013) Methods Mol Biol 931, 97-109» . Колокализационный анализ в флуоресцентной микроскопии . Проверено 19 апреля 2016 г.
  17. ^ Гельлес, Фридман Л. (17 февраля 2012 г.). «Механизм инициации транскрипции на активатор-зависимом промоторе, определенный путем наблюдения за одиночной молекулой» . Клетка . 148 (4): 635–637. дои : 10.1016/j.cell.2012.01.018 . ПМЦ   3479156 . ПМИД   22341441 .
  18. ^ Зинчук, В; и др. (2013). «Преодоление разрыва между качественными и количественными результатами колокализации в исследованиях флуоресцентной микроскопии» . Научный представитель . 3 : 1365. дои : 10.1038/srep01365 . ПМЦ   3586700 . ПМИД   23455567 .
  19. ^ Pipsqueak Pro от Rewire Neuro
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 0a225220a6c6bd478a2eb7ab8f81a44e__1690285860
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/0a/4e/0a225220a6c6bd478a2eb7ab8f81a44e.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Colocalization - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)