Колокализация
В флуоресцентной микроскопии колокализация означает наблюдение пространственного перекрытия между двумя (или более) разными флуоресцентными метками, каждая из которых имеет отдельную длину волны излучения, чтобы увидеть, расположены ли разные «мишени» в одной и той же области клетки или очень близко к ней. друг друга. Это определение можно разделить на два разных явления: совместное появление, которое относится к присутствию двух (возможно, не связанных между собой) флуорофоров в одном и том же пикселе, и корреляция, гораздо более значительная статистическая связь между флуорофорами, указывающая на биологическое взаимодействие. [1] Этот метод важен для многих клеточных биологических и физиологических исследований при демонстрации взаимоотношений между парами биомолекул.
История
[ редактировать ]Способность продемонстрировать корреляцию между парой биомолекул была значительно расширена Эриком Мандерсом из Амстердамского университета, который представил коэффициент корреляции Пирсона (PCC). микроскопистам [2] наряду с другими коэффициентами, наиболее популярными и полезными оказались «коэффициенты перекрытия» M1 и M2. [3] [4] Цель использования коэффициентов - охарактеризовать степень перекрытия между изображениями, обычно двумя каналами в многомерном микроскопическом изображении, записанном на разных длинах волн излучения. Популярный подход был предложен Сильвеном Костесом, который использовал коэффициент корреляции Пирсона как инструмент для объективной установки пороговых значений, требуемых M1 и M2. [5] Подход Костеса предполагает, что интерес представляют только положительные корреляции, и не обеспечивает полезного измерения PCC.
Хотя использование коэффициентов может значительно повысить надежность обнаружения колокализации, это зависит от ряда факторов, в том числе от условий подготовки образцов с флуоресценцией и способа получения и обработки изображений с колокализацией. Исследования следует проводить с большой осторожностью и после тщательного ознакомления. В настоящее время в этой области царит путаница, и стандартизированный подход еще не установлен. [6] Попытки исправить это включают пересмотр и пересмотр некоторых коэффициентов. [7] [8] применение коэффициента для коррекции шума, [1] «Корреляции с коррекцией шума на основе репликации для точных измерений колокализации». [9] и предложение дальнейших протоколов, [10] которые были тщательно рассмотрены Болте и Кордельером (2006). [6] Кроме того, из-за тенденции флуоресцентных изображений содержать определенное количество расфокусированного сигнала, пуассоновского выстрела и других шумов, они обычно требуют предварительной обработки перед количественной оценкой. [11] [12] Тщательное восстановление изображения путем деконволюции удаляет шум и увеличивает контраст изображений, улучшая качество результатов анализа колокализации. До сих пор наиболее часто используемые методы количественной оценки колокализации рассчитывают статистическую корреляцию интенсивностей пикселей в двух различных каналах микроскопии. Более поздние исследования показали, что это может привести к высоким коэффициентам корреляции даже для целей, которые, как известно, находятся в разных клеточных компартментах. [13] Более надежная количественная оценка колокализации может быть достигнута путем объединения распознавания цифровых объектов, расчета перекрытия областей и комбинации со значением корреляции интенсивности пикселей. Это привело к концепции объектно-скорректированного коэффициента корреляции Пирсона. [13]
Примеры использования
[ редактировать ]непроницаемые флуоресцентные цинковые красители могут заметно маркировать цитозоль и ядра апоптизирующих Некоторые и некротизирующих клеток в каждом из четырех исследованных типов тканей. А именно: кора головного мозга , гиппокамп , мозжечок , а также было продемонстрировано, что колокализованное обнаружение увеличения цинка и общепринятого индикатора гибели клеток йодида пропидия также происходит в клетках почек. Использование принципов флуоресцентной колокализации. Было продемонстрировано одновременное обнаружение накопления цинка и поглощения йодида пропидия (традиционного индикатора гибели клеток) в нескольких типах клеток. [14] Различные примеры количественной оценки колокализации в области нейробиологии можно найти в обзоре. [15] Подробные протоколы количественной оценки колокализации можно найти в главе книги. [16]
Разрешение одной молекулы
[ редактировать ]Колокализация используется во флуоресцентной микроскопии одиночных молекул в реальном времени для обнаружения взаимодействий между флуоресцентно меченными молекулярными видами. В этом случае один вид (например, молекула ДНК) обычно иммобилизуется на поверхности визуализации, а другой вид (например, ДНК-связывающий белок) подается в раствор. Оба вида помечены красителями спектрально разрешенных цветов (>50 нм), например цианином-3 и цианином-5. Возбуждение флуоресценции обычно осуществляется в режиме полного внутреннего отражения, что увеличивает отношение сигнал/шум для молекул на поверхности по сравнению с молекулами в объемном растворе. Молекулы обнаруживаются как пятна, появляющиеся на поверхности в режиме реального времени, а их местоположение определяется с точностью до 10-20 нм путем подбора функций разброса точек. Поскольку типичные размеры биомолекул составляют порядка 10 нм, такой точности обычно достаточно для определения молекулярных взаимодействий. [17]
Интерпретация результатов
[ редактировать ]С целью лучшей интерпретации результатов качественных и количественных исследований колокализации было предложено использовать набор из пяти лингвистических переменных, привязанных к значениям коэффициентов колокализации, таких как очень слабая , слабая , умеренная , сильная и очень сильная , для их описания. Подход основан на использовании нечеткой модели системы и компьютерного моделирования. При введении новых коэффициентов их значения могут быть включены в набор. [18]
Связанные методы
[ редактировать ]- Резонансная передача энергии Фёрстера (FRET): близость 10 нм
- ( Световая микроскопия : разрешение всего 250 нм; нет уверенности в эффективном взаимодействии)
- Раскрывающиеся списки / раскрывающиеся списки иммунопреципитации (IP)
- Гибрид дрожжей 2 — картирование взаимодействия белков
Контрольные изображения
[ редактировать ]Степень колокализации на изображениях флуоресцентной микроскопии можно проверить с помощью источника тестов колокализации — бесплатной коллекции загружаемых наборов изображений с заранее заданными значениями колокализации.
Реализации программного обеспечения
[ редактировать ]открытый исходный код
[ редактировать ]- FIJI — это просто ImageJ — батарейки в комплекте
- БиоИзображение XD
закрытый исходный код
[ редактировать ]- Модуль колокализации AxioVision
- Программное обеспечение для исследования колокализации
- CoLocalizer Pro CoLocalizer Pro
- Модуль колокализации NIS-Elements от Nikon
- Анализатор колокализации Гюйгенса от Scientific Volume Imaging
- Volocity от Quorum Technology
- Image-Pro от Media Cybernetics
- В Имаре Bitplane
- пришел Vision4D
- [19]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б Адлер и др. (2008)
- ^ Мандерс и др. (1992). «Динамика трехмерных моделей репликации во время S-фазы, проанализированная с помощью двойного мечения ДНК и конфокальной микроскопии». [1]
- ^ Мандерс; и др. (1993). «Измерение совместной локализации объектов на двухцветных конфокальных изображениях». Журнал микроскопии . 169 (3): 375–382. дои : 10.1111/j.1365-2818.1993.tb03313.x . ПМИД 33930978 . S2CID 95098323 .
- ^ Зинчук В и др. (2007). «Количественный анализ колокализации многоцветных изображений конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии: использование пикселей для исследования биологических явлений». Acta Histochem Cytochem 40:101-111.
- ^ Костес и др. (2004) «Автоматическое и количественное измерение белок-белковой колокализации в живых клетках». [2]
- ^ Перейти обратно: а б БОЛТЕ и КОРДЕЛЬЕР (2006) «Экскурсия по анализу субклеточной колокализации в световой микроскопии». [3]
- ^ Адлер и Пармрид (2010) «Количественная оценка колокализации посредством корреляции: коэффициент корреляции Пирсона превосходит коэффициент перекрытия Мандера». [4]
- ^ Краус и др. (2015). «Колокализация флуоресцентных и рамановских микроскопических изображений для идентификации субклеточных компартментов: проверочное исследование». Аналитик, том 140, выпуск 7, страницы 2360-2368. [5]
- ^ Адлер, Дж.; Пагакис, С.Н.; Пармрид, И. (1 апреля 2008 г.). «Корреляция с поправкой на шум на основе репликации для точных измерений колокализации». Журнал микроскопии . 230 (1): 121–133. дои : 10.1111/j.1365-2818.2008.01967.x . ПМИД 18387047 . S2CID 12758752 .
- ^ Curr Protoc Cell Biol «Количественный анализ колокализации изображений конфокальной флуоресцентной микроскопии». Архивировано 28 ноября 2009 г. в Wayback Machine.
- ^ Поли Дж.Б. (2006). Справочник по биологической конфокальной микроскопии
- ^ Зинчук В и др. (2011). «Количественная оценка пространственных корреляций флуоресцентных маркеров с использованием усиленного снижения фона с помощью оценки индекса близости белков и коэффициентов корреляции». Нат Проток 6:1554-1567.
- ^ Перейти обратно: а б Мозер, Бернхард; Хохрейтер, Бернхард; Хербст, Рут; Шмид, Йоханнес А. (01 июля 2016 г.). «Анализ флуоресцентной колокальной микроскопии можно улучшить, объединив распознавание объектов с корреляцией интенсивности пикселей» . Биотехнологический журнал . 12 (1): 1600332. doi : 10.1002/biot.201600332 . ISSN 1860-7314 . ПМК 5244660 . ПМИД 27420480 .
- ^ Сторк, Кристиан Дж.; Ли, Ян В. (15 сентября 2006 г.). «Измерение жизнеспособности клеток с помощью непроницаемого для мембран цинкового флуоресцентного индикатора». Журнал методов нейробиологии . 155 (2): 180–186. doi : 10.1016/j.jneumeth.2005.12.029 . ПМИД 16466804 . S2CID 16900662 .
- ^ Зинчук В. и Гроссенбахер-Зинчук О. (2009). «Последние достижения в количественном анализе колокализации: фокус на нейробиологии». Прог Гистохем Цитохем 44:125-172
- ^ «Адлер Дж. и Пармрид I (2013) Methods Mol Biol 931, 97-109» . Колокализационный анализ в флуоресцентной микроскопии . Проверено 19 апреля 2016 г.
- ^ Гельлес, Фридман Л. (17 февраля 2012 г.). «Механизм инициации транскрипции на активатор-зависимом промоторе, определенный путем наблюдения за одиночной молекулой» . Клетка . 148 (4): 635–637. дои : 10.1016/j.cell.2012.01.018 . ПМЦ 3479156 . ПМИД 22341441 .
- ^ Зинчук, В; и др. (2013). «Преодоление разрыва между качественными и количественными результатами колокализации в исследованиях флуоресцентной микроскопии» . Научный представитель . 3 : 1365. дои : 10.1038/srep01365 . ПМЦ 3586700 . ПМИД 23455567 .
- ^ Pipsqueak Pro от Rewire Neuro