гемоцитометр

Гемоцитометр (или гемоцитометр ) — устройство со счетной камерой, первоначально предназначенное и обычно используемое для подсчета клеток крови . ^[1]

Гемоцитометр был изобретен Луи-Шарлем Малассе и состоит из толстого предметного стекла микроскопа с прямоугольным углублением, образующим прецизионную объемную камеру. Эта камера украшена лазерной гравировкой из перпендикулярных линий. Устройство тщательно изготовлено таким образом, чтобы была известна площадь, ограниченная линиями, а также известна глубина камеры. Таким образом, наблюдая за определенной областью сетки, можно подсчитать количество клеток или частиц в определенном объеме жидкости и тем самым рассчитать концентрацию клеток в жидкости в целом. Широко используемым типом гемоцитометра является счетная камера Нойбауэра . ^[2]

Для разных целей используются другие типы гемоцитометров с другими правилами. Правила Фукса-Розенталя, обычно используемые для подсчета спинномозговой жидкости, правила Говарда Молда, используемые для определения плесени на пищевых продуктах и упаковочных продуктах, правила Макмастера, используемые для подсчета микробных яиц в фекалиях, правила камеры Нажотта для подсчета низких уровней лейкоцитов в белом цвете компоненты тромбоцитов с пониженным содержанием клеток, правило Palmer Nanoplankton для подсчета более мелких планктеров. Счетчик Петрова-Хауссера, использующий улучшенные правила Нойбауэра, используется для подсчета бактерий или сперматозоидов и предлагается с различной глубиной камеры. Линейка ячеек Седжвика-Рафтера в гемоцитометре в первую очередь предназначена для использования в микроскопии питьевой воды.

Принципы

Сетчатая область усовершенствованного гемоцитометра с линейкой Нойбауэра состоит из девяти ячеек размером 1 х 1 мм (1 мм). ²) квадраты. Они подразделяются на три направления; 0,25 х 0,25 мм (0,0625 мм ²), 0,25 х 0,20 мм (0,05 мм ²) и 0,20 х 0,20 мм (0,04 мм ²). Центральный квадрат дополнительно подразделяется на 0,05 х 0,05 мм (0,0025 мм). ²) квадраты. Приподнятые края гемоцитометра удерживают покровное стекло на расстоянии 0,1 мм от отмеченной сетки, придавая каждому квадрату определенный объем (см. рисунок справа). ^[3]

Размеры	Область	Объем на глубине 0,1 мм
1 х 1 мм	1 мм ²	100 нл
0,25 х 0,25 мм	0,0625 мм ²	6,25 нл
0,25 х 0,20 мм	0,05 мм ²	5 нл
0,20 х 0,20 мм	0,04 мм ²	4 нл
0,05 х 0,05 мм	0,0025 мм ²	0,25 нл

Использование

Перед использованием гемоцитометра сначала убедитесь, что специальное покровное стекло, входящее в комплект счетной камеры, правильно расположено на поверхности счетной камеры. Когда две стеклянные поверхности находятся в правильном контакте, кольца Ньютона можно наблюдать . В этом случае клеточная суспензия наносится на край покровного стекла и всасывается в пустоту под действием капилляров , полностью заполняя камеру образцом. Количество клеток в камере можно определить путем прямого подсчета с помощью микроскопа , а визуально различимые клетки можно подсчитать дифференциально. Количество клеток в камере используется для расчета концентрации или плотности клеток в смеси, из которой получен образец. Это количество клеток в камере, разделенное на объем камеры, который известен с самого начала, с учетом любых разведений и сокращений подсчета:

${\mbox{concentration of cells in original mixture}}=\left({\frac {\mbox{number of cells counted}}{({\mbox{proportion of chamber counted}})({\mbox{volume of squares counted}})}}\right)\left({\frac {\mbox{volume of diluted sample}}{\mbox{volume of original mixture in sample}}}\right)$ ^[4]

${\mbox{cells/mL}}=\left({\frac {({\mbox{number of cells counted}})({\mbox{dilution factor}})}{({\mbox{number of large squares counted}})}}\right)\times 10000$

где объем разбавленной пробы (после разбавления), разделенный на объем исходной смеси в пробе (до разбавления), представляет собой коэффициент разбавления . Например, если объем исходной смеси составлял 20 мкл и она была разбавлена один раз (путем добавления 20 мкл разбавителя), то второй член в скобках будет 40 мкл/20 мкл. Объем подсчитанных квадратов указан в таблице вверху, в зависимости от размера (см. рисунок справа). Количество подсчитанных клеток представляет собой сумму всех клеток, подсчитанных в квадратах одной камеры. Пропорция подсчитанных ячеек применяется, если подсчитаны не все внутренние квадраты внутри заданного квадрата (т. е. если подсчитаны только 4 из 20 в угловом квадрате, то этот член будет равен 0,2). При подсчете больших квадратов объемом 100 нанолитр (нл) умножение на 10000 приводит к желаемому количеству клеток на миллилитр.

Части гемоцитометра (вид сбоку) идентифицируются.

В большинстве случаев используются только четыре больших угловых квадрата. Ячейки, находящиеся на верхней и левой линиях или соприкасающиеся с ними, подсчитываются, но ячейки, находящиеся на правой или нижней линиях или соприкасающиеся с ними, игнорируются. ^[5]

Требования

Исходную суспензию необходимо тщательно перемешать перед взятием пробы. Это гарантирует, что образец будет репрезентативным, а не просто артефактом конкретной области исходной смеси, из которой он был взят.

Следует использовать соответствующее разведение смеси с учетом количества подсчитываемых клеток. Если образец недостаточно разбавлен, клетки будут слишком переполнены и их будет трудно подсчитать. Если он слишком разбавлен, размера выборки будет недостаточно, чтобы сделать однозначные выводы о концентрации в исходной смеси.

Результаты можно сравнить, выполнив дублирующий тест на второй камере. Если они различаются более чем в 2 раза, то погрешность счета (квадратный корень из счета ^[6]), метод отбора пробы может быть ненадежным (например, исходная смесь не тщательно перемешана).

Счетная камера должна заполняться капиллярным путем после установки крышки камеры (специального покровного стекла сертифицированной толщины и плоскостности). Это позволяет избежать риска того, что клетки могут осаждаться/прилипать к стеклу или испаряться в некотором объеме до того, как покровное стекло будет помещено сверху, что приведет к завышению концентрации клеток. Седиментация представляет собой меньшую проблему для бактерий, но испарение, более распространенное в кондиционируемых лабораториях с низкой влажностью, все же необходимо свести к минимуму.

Приложения

Анализы крови : для пациентов с аномальными клетками крови, когда автоматические счетчики работают неэффективно.
Количество сперматозоидов
Микроскопия мочи
Культура клеток: при субкультивировании или регистрации роста клеток с течением времени.
Пивоварение : для приготовления дрожжей.
фитопланктона Подсчет клеток
) необходимо точное количество клеток Обработка клеток для последующего анализа: во многих тестах ( ПЦР , проточная цитометрия , в то время как некоторые другие требуют высокой жизнеспособности клеток.
Измерение размера клеток: на микрофотографии реальный размер клеток можно определить, масштабируя его до известной ширины квадрата гемоцитометра. ^[7]

Ссылки

^ Абшер, Марлен (1973). «Подсчет гемоцитометра». Тканевая культура . стр. 395–397. дои : 10.1016/B978-0-12-427150-0.50098-X . ISBN 9780124271500 .
^ «Рис. 8. Виды улучшенного предметного стекла правящего гемоцитометра Нойбауэра. (А) Вид сверху…» ResearchGate . Проверено 29 марта 2018 г.
^ «Размер квадрата гемоцитометра • Гемоцитометр» . 11 апреля 2013 г.
^ «Подсчет клеток с помощью камеры Нойбауэра - основы использования гемоцитометра, Оскар Бастидас» (PDF) .
^ Стробер В. (2001). «Мониторинг роста клеток». В Колиган Дж.Э., Бирер Б.Е., Маргулис Д.Х., Шерах Э.М., Стробер В. (ред.). Современные протоколы в иммунологии . Том. 5. США:Джон Уайли и сыновья. п. А.2А.1. дои : 10.1002/0471142735.ima03as21 . ISBN 0471142735 . ПМИД 18432653 .
^ Шапиро, Ховард (31 января 2001 г.). «очень редкие события: как низко можно опуститься?» .
^ «Измерение размера клеток гемоцитометром» . Архивировано из оригинала 29 июня 2012 г. Проверено 2 июня 2013 г.

Внешние ссылки

Онлайн-упражнение - Подсчет дрожжей в улучшенных счетных камерах Нойбауэра или Тома
Калькулятор гемоцитометра онлайн
Типы гемоцитометров

[Absher1973-1] Абшер, Марлен (1973). «Подсчет гемоцитометра». Тканевая культура . стр. 395–397. дои : 10.1016/B978-0-12-427150-0.50098-X . ISBN 9780124271500 .

[neubauer-2] «Рис. 8. Виды улучшенного предметного стекла правящего гемоцитометра Нойбауэра. (А) Вид сверху…» ResearchGate . Проверено 29 марта 2018 г.

[3] «Размер квадрата гемоцитометра • Гемоцитометр» . 11 апреля 2013 г.

[4] «Подсчет клеток с помощью камеры Нойбауэра - основы использования гемоцитометра, Оскар Бастидас» (PDF) .

[5] Стробер В. (2001). «Мониторинг роста клеток». В Колиган Дж.Э., Бирер Б.Е., Маргулис Д.Х., Шерах Э.М., Стробер В. (ред.). Современные протоколы в иммунологии . Том. 5. США:Джон Уайли и сыновья. п. А.2А.1. дои : 10.1002/0471142735.ima03as21 . ISBN 0471142735 . ПМИД 18432653 .

[6] Шапиро, Ховард (31 января 2001 г.). «очень редкие события: как низко можно опуститься?» .

[7] «Измерение размера клеток гемоцитометром» . Архивировано из оригинала 29 июня 2012 г. Проверено 2 июня 2013 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]