Тест удлинения Poly(A)
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти шаблонные сообщения )
|
Расширенный тест Poly(A) Test (ePAT) описывает метод определения длины хвоста поли(A) мРНК молекул . Он был разработан и описан A. Jänicke et al. в 2012 году.
Метод состоит из трех отдельных этапов: на первом этапе полиаденилированную РНК гибридизуют с ДНК- олигонуклеотидом, имеющим полидезокситимидиновую последовательность на 5'-конце. Затем полимераза Кленова катализирует удлинение 3'-конца мРНК, используя ДНК-олигонуклеотид в качестве матрицы. Реакция протекает при 25°С. На втором этапе синтез обратной транскриптазы удлиняет олигонуклеотиды ДНК, которые отжигались с расширенным 3'-концом мРНК. Чтобы гарантировать, что олигомеры ДНК, гибридизованные с внутренними последовательностями поли(А), не служат праймерами для обратной транскрипции, второй этап проводят при 55 °C. Третий и последний этап включает амплификацию вновь синтезированной кДНК посредством ПЦР . Для этой ПЦР требуется один генспецифичный и один универсальный праймер. Анализ длин ампликонов позволяет оценить последовательность, фланкированную двумя праймерами, т.е. длину поли(А)-хвоста мРНК образца.
По мнению авторов, измерение длин хвостов поли(А) и их распределения среди различных транскриптов позволяет использовать этот метод для определения состояния трансляции клетки вместо более утомительного анализа состояний трансляции белков. [ 1 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Янике А., Ванкуйленберг Дж., Боаг П.Р., Травен А., Бейлхарц Т.Д. (июнь 2012 г.). «ePAT: простой метод мечения аденилированной РНК для измерения длины поли(А)-хвоста и других применений 3' RACE» . РНК . 18 (6): 1289–95. дои : 10.1261/rna.031898.111 . ПМЦ 3358650 . ПМИД 22543866 .