Минфлюкс

MINFLUX , или микроскопия с минимальным потоком флуоресцентных фотонов, представляет собой метод световой микроскопии сверхвысокого разрешения , который позволяет отображать и отслеживать объекты в двух и трех измерениях с однозначным нанометровым разрешением.

MINFLUX использует структурированный луч возбуждения, по крайней мере, с одним минимумом интенсивности (обычно это луч в форме пончика с нулевой центральной интенсивностью) для получения эмиссии фотонов из флуорофора. Положение возбуждающего луча контролируется с точностью до субнанометра, и когда нулевая интенсивность располагается точно на флуорофоре, система не регистрирует излучение. Таким образом, системе требуется несколько испускаемых фотонов для определения местоположения флуорофора с высокой точностью. На практике перекрытие нулевой интенсивности и флуорофора потребует априорных знаний о местоположении для позиционирования луча. Поскольку это не так, луч возбуждения перемещается по определенной схеме, чтобы исследовать излучение флуорофора вблизи минимума интенсивности.

Каждая локализация занимает менее 5 микросекунд, поэтому MINFLUX может создавать изображения нанометрических структур или отслеживать отдельные молекулы в фиксированных и живых образцах, объединяя местоположения флуоресцентных меток. Поскольку цель состоит в том, чтобы найти точку, в которой флуорофор перестает излучать, MINFLUX значительно уменьшает количество фотонов флуоресценции, необходимых для локализации, по сравнению с другими методами.

Коммерческую систему MINFLUX можно приобрести у компании Abberior Instruments GmbH.

Принцип

MINFLUX преодолевает дифракционный предел Аббе в световой микроскопии и различает отдельные флуоресцирующие молекулы, используя фотофизические свойства флуорофоров. Система временно подавляет (переводит в выключенное состояние) все молекулы, кроме одной, в пределах дифракционно-ограниченной области (DLA), а затем обнаруживает эту единственную активную (в включенном состоянии) молекулу. Методы микроскопии сверхвысокого разрешения, такие как микроскопия стохастической оптической реконструкции (STORM) и микроскопия фотоактивируемой локализации (PALM), делают то же самое. Однако MINFLUX отличается тем, как он определяет местоположение молекулы.

Луч возбуждения, используемый в MINFLUX, имеет локальный минимум или нулевую интенсивность. Положение нуля интенсивности в образце регулируется с помощью управляющей электроники и исполнительных механизмов с субнанометровой пространственной и субмикросекундной временной точностью. Когда активная молекула, расположенная в ${\vec {r}}_{m}$ находится в области ненулевой интенсивности пучка возбуждения, он флуоресцирует. Количество фотонов $n$ излучаемый активной молекулой, пропорционален интенсивности возбуждающего луча в этом положении.

Когда активная флуоресцентная молекула находится вблизи нулевой интенсивности возбуждающего луча MINFLUX, количество излучаемых ею фотонов пропорционально интенсивности возбуждающего луча в этом положении. Интенсивность этого излучения можно аппроксимировать квадратичной функцией. На этой одномерной диаграмме запись излучения фотонов с помощью возбуждающего луча в двух разных положениях позволяет оценить минимум интенсивности между двумя точками, соответствующий предполагаемому положению активной молекулы.

Вблизи нуля интенсивности возбуждающего пучка интенсивность $I$ излучения активной молекулы, когда нулевая интенсивность находится в положении ${\vec {r}}$ можно аппроксимировать квадратичной функцией. Следовательно, зарегистрированное количество фотонов излучения равно:

$n({\vec {r}},{\vec {r}}_{m})=cI=c({\vec {r}}-{\vec {r}}_{m})^{2}$

где $c$ является мерой эффективности обнаружения, сечения поглощения эмиттера и квантового выхода флуоресценции.

Другими словами, потоки фотонов, испускаемые активной молекулой, когда она находится вблизи точки нулевой интенсивности пучка возбуждения, несут информацию о ее расстоянии до центра пучка. Эту информацию можно использовать для определения положения активной молекулы. Положение исследуется набором $K$ интенсивности возбуждения $\{I_{0},...,I_{K-1}\}$. Например, активная молекула возбуждается одним и тем же лучом в форме бублика, перемещаемым в разные положения. Результатом зондирования является соответствующий набор отсчетов фотонов. $\{n_{0},...,n_{K-1}\}$. Эти количества фотонов являются вероятностными; каждый раз, когда измеряется такой набор, результатом является разная реализация числа фотонов, колеблющегося вокруг среднего значения. Поскольку их распределение соответствует статистике Пуассона, ожидаемое положение активной молекулы можно оценить по числу фотонов, используя, например, оценку максимального правдоподобия вида:

${\widehat {{\vec {r}}_{m}}}=argmax{\mathcal {L}}({\vec {r}}\mid \{n_{0},...,n_{K-1}\})$

Позиция ${\widehat {{\vec {r}}_{m}}}$ максимизирует вероятность того, что измеренный набор отсчетов фотонов произошел точно так, как записано, и, таким образом, является оценкой местоположения активной молекулы.

Процесс локализации

MINFLUX локализует активную флуоресцентную молекулу, используя схему зондирования. Возбуждающий луч в форме пончика располагается в разных точках на периферии и в середине зоны L. зондирования Активная молекула возбуждается в каждой позиции и регистрируются потоки фотонов. MINFLUX использует диаграммы потока этих записей, чтобы переместить луч возбуждения так, чтобы он сосредоточился на активной молекуле, а затем выполняет еще одну итерацию зондирования. С каждой итерацией зона зондирования L сужается, и нулевая интенсивность возбуждающего луча более точно перекрывается с положением активной молекулы.

Записи излучающей активной молекулы в двух разных положениях луча возбуждения необходимы для использования квадратичного приближения в одномерном базовом принципе, описанном выше. Каждая запись обеспечивает одномерное значение расстояния до центра луча возбуждения. В двух измерениях необходимо как минимум три точки записи, чтобы определить местоположение, которое можно использовать для перемещения луча возбуждения MINFLUX к молекуле-мишени. Эти точки записи разграничивают зону L. зондирования Бальзаротти и др. используйте предел Крамера-Рао, чтобы показать, что сужение этой области зондирования значительно улучшает точность локализации, в большей степени, чем увеличение количества испускаемых фотонов:

$\sigma _{B}\propto {\frac {L}{\sqrt {N}}}$

где $\sigma _{B}$ – предел Крамера-Рао, $L$ - диаметр зоны зондирования, а $N$ — количество испущенных фотонов.

MINFLUX использует эту функцию при локализации активного флуорофора. Он регистрирует потоки фотонов по схеме зондирования, состоящей не менее чем из трех точек регистрации вокруг зоны зондирования. $L$ и одна точка в центре. Эти потоки различаются в каждой точке регистрации, поскольку активная молекула возбуждается светом разной интенсивности. Эти закономерности потока определяют перемещение области зондирования в центр активной молекулы. Затем процесс зондирования повторяется. С каждой итерацией зондирования MINFLUX сужает область зондирования. $L$, сужая пространство, в котором может находиться активная молекула. Таким образом, расстояние, остающееся между нулевой интенсивностью и активной молекулой, определяется точнее на каждой итерации. Постоянно улучшающаяся информация о положении сводит к минимуму количество фотонов флуоресценции и время, необходимое MINFLUX для достижения точной локализации.

Приложения

Объединяя определенные местоположения нескольких флуоресцентных молекул в образце, MINFLUX генерирует изображения наноскопических структур с разрешением 1–3 нм. MINFLUX использовался для изображения ДНК-оригами. и комплекс ядерных пор и выяснить архитектуру субклеточных структур митохондрий и фоторецепторов. Поскольку MINFLUX не собирает большое количество фотонов, испускаемых целевыми молекулами, локализация происходит быстрее, чем при использовании традиционных систем на основе камеры. Таким образом, MINFLUX может итеративно локализовать одну и ту же молекулу с микросекундными интервалами в течение определенного периода. MINFLUX использовался для отслеживания движения моторного белка кинезина-1 как in vitro , так и in vivo . и отслеживать конфигурационные изменения механочувствительного ионного канала PIEZO1.

См. также

• Конфокальная микроскопия
• флуоресценция
• Флуоресцентный микроскоп
• Флуоресцентная резонансная микроскопия с переносом энергии
• Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
• Оптическая микроскопия
• Фотоактивируемая локализационная микроскопия
• Стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия
• Микроскопия сверхвысокого разрешения
• Микроскопия истощения основного состояния
• РЕШАТЬ