РЕШАТЬ

RESOLFT , аббревиатура от Saturable REversible Optica Fluorescent L . группу Transitions обозначает , методов оптической флуоресцентной микроскопии с очень высоким разрешением Используя стандартную оптику видимого света в дальнем поле, разрешение намного ниже дифракционного предела можно получить вплоть до молекулярных масштабов.

С помощью традиционных методов микроскопии невозможно различить особенности, расположенные на расстояниях менее половины используемой длины волны (т.е. около 200 нм для видимого света ). Этот дифракционный предел основан на волновой природе света . В обычных микроскопах предел определяется используемой длиной волны и числовой апертурой оптической системы. Концепция RESOLFT преодолевает этот предел, временно переводя молекулы в состояние, в котором они не могут посылать сигнал (флуоресценции) при освещении. Эта концепция отличается, например, от электронной микроскопии , где вместо этого используемая длина волны намного меньше.

Принцип работы

Микроскопия RESOLFT — это оптическая микроскопия с очень высоким разрешением, которая позволяет отображать детали образцов, которые невозможно визуализировать с помощью традиционной или конфокальной микроскопии . В рамках RESOLFT принципы STED-микроскопии ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} и GSD-микроскопия являются обобщенными. Структуры, которые обычно расположены слишком близко друг к другу, чтобы их можно было различить, считываются последовательно.

В рамках этой концепции можно объяснить все методы, которые действуют на молекулах, которые имеют по крайней мере два различимых состояния, где возможно обратимое переключение между двумя состояниями и где по крайней мере один такой переход может быть индуцирован оптически.

В большинстве случаев используются флуоресцентные маркеры, у которых одно состояние (А) яркое, то есть генерирует сигнал флуоресценции, а другое состояние (В) темное и не дает сигнала. Один переход между ними может быть вызван светом (например, A→B, от яркого к темному).

Образец освещается неоднородно, интенсивность освещения в одном положении очень мала (в идеальных условиях равна нулю). Только в этом месте молекулы никогда не находятся в темном состоянии B (если A — уже существующее состояние) и полностью остаются в светлом состоянии A. Область, где молекулы находятся преимущественно в светлом состоянии, можно сделать очень маленькой (меньше, чем обычный дифракционный предел) за счет увеличения интенсивности переходного света (см. ниже). Таким образом, известно, что любой обнаруженный сигнал исходит только от молекул в небольшой области вокруг минимума интенсивности освещения. Изображение высокого разрешения можно построить путем сканирования образца, т. е. смещения профиля освещенности по поверхности. ^{[ 3 ]}

Обратный переход от B к A может быть либо спонтанным, либо вызванным светом другой длины волны. Молекулы должны переключаться несколько раз, чтобы находиться в состоянии A или B в разное время во время сканирования образца. Этот метод также работает, если поменять местами светлое и темное состояние, тогда получается негативное изображение.

Разрешение ниже дифракционного предела

В RESOLFT область, где молекулы находятся в состоянии A (яркое состояние), можно сделать сколь угодно маленькой, несмотря на дифракционный предел.

Необходимо осветить образец неоднородно, чтобы образовалась изолированная точка нулевой интенсивности. Этого можно достичь, например, путем вмешательства.
При низкой интенсивности (ниже синей линии на изображении) большинство молекул маркера находятся в светлом состоянии, если интенсивность выше, большинство маркеров находятся в темном состоянии.

При слабом освещении мы видим, что область, где молекулы остаются в состоянии А, все еще довольно велика, поскольку освещение настолько низкое, что большинство молекул находится в состоянии А. Форму профиля освещения менять не нужно. Увеличение яркости освещения уже приводит к уменьшению площади, где интенсивность ниже величины, необходимой для эффективного переключения в темное состояние. Следовательно, также уменьшается площадь, где молекулы могут находиться в состоянии А. Сигнал (флуоресценции) во время последующего считывания исходит из очень маленького пятна, и можно получить очень четкие изображения.

В концепции RESOLFT разрешение можно аппроксимировать выражением $\Delta d\simeq {\frac {\lambda }{\pi n{\sqrt {\frac {I}{Isat}}}}}$ , в результате чего $I_{sat}$ – характерная интенсивность, необходимая для насыщения перехода (половина молекул остается в состоянии A, а половина – в состоянии B), $I$ обозначает приложенную интенсивность. Если минимумы создаются фокусирующей оптикой с числовой апертурой ${\mbox{NA}}=n\sin \alpha$ Минимальное расстояние, на котором можно различить два одинаковых объекта, равно $\Delta d={\frac {\lambda }{2n\cdot \sin \alpha \cdot {\sqrt {1+{\frac {I}{Isat}}}}}}$ которое можно рассматривать как расширение уравнения Аббе . Дифракционно-неограниченная природа концепций семейства RESOLFT отражается в том факте, что минимальное разрешимое расстояние $\Delta d$ можно непрерывно уменьшать, увеличивая $\varsigma ={\frac {I}{Isat}}$ . Следовательно, поиск наноразмерного разрешения сводится к максимизации этой величины. Это возможно за счет увеличения $I$ или путем понижения $I_{sat}$ .

Варианты

При переключении состояний молекул используются разные процессы. Однако общим для всех является то, что используются как минимум два различимых состояния. Обычно используемое свойство флуоресценции отмечает различие состояний, однако это не является существенным, поскольку также можно использовать свойства поглощения или рассеяния. ^{[ 4 ]}

СТЭД микроскопия

(Основная статья STED-микроскопия )

В рамках STED-микроскопии (STimulated Emission Depletion микроскопия) ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Молекула флуоресцентного красителя перемещается между основным электронным состоянием и возбужденным состоянием, излучая при этом фотоны флуоресценции. Это стандартный режим работы флуоресцентной микроскопии, который описывает состояние A. В состоянии B краситель постоянно сохраняется в своем основном электронном состоянии за счет стимулированного излучения . Если краситель может флуоресцировать в состоянии A, а не в состоянии B, применяется концепция RESOLFT.

GSD-микроскопия

(Основная статья GSD-микроскопия )

В микроскопии GSD (микроскопия истощения основного состояния) также используются флуоресцентные маркеры. В состоянии А молекула может свободно перемещаться между основным и первым возбужденным состоянием, и может излучаться флуоресценция. В темновом состоянии Б основное состояние молекулы опустошается, происходит переход в долгоживущее возбужденное состояние, из которого флуоресценция не излучается. Пока молекула находится в темном состоянии, она не может переключаться между основным и возбужденным состояниями, поэтому флуоресценция отключается.

СПЕМ и ССИМ

SPEM (микроскопия с возбуждением насыщенного типа) ^{[ 5 ]} и SSIM (микроскопия с насыщенным структурированным освещением) ^{[ 6 ]} используют концепцию RESOLFT, используя насыщенное возбуждение для создания «негативных» изображений, то есть флуоресценция происходит повсюду, за исключением очень маленькой области вокруг геометрического фокуса микроскопа. Также для освещения используются неточечные узоры. Математическая реконструкция изображения необходима, чтобы снова получить положительные изображения.

RESOLFT с переключаемыми белками

Некоторые флуоресцентные белки можно включать и выключать светом соответствующей длины волны. Их можно использовать в микроскопе типа РЕЗОЛЬФТ. ^{[ 7 ]} При освещении светом эти белки меняют свою конформацию. При этом они приобретают или теряют способность излучать флуоресценцию. Флуоресцентное состояние соответствует состоянию A, нефлуоресцирующее состояние B, и снова применяется концепция RESOLFT. Обратимый переход (например, от B обратно к A) происходит либо спонтанно, либо снова под действием света. Индуцирование конформационных изменений в белках может быть достигнуто уже при гораздо более низких интенсивностях переключаемого света по сравнению со стимулированным излучением или истощением основного состояния (несколько Вт/см). ²). В сочетании с микроскопией 4Pi были получены изображения живых клеток с изотропным разрешением ниже 40 нм при низких уровнях освещенности. ^{[ 8 ]}

RESOLFT с переключаемыми органическими красителями

Как и белки, некоторые органические красители могут менять свою структуру при освещении. ^{[ 9 ]}^{[ 10 ]} Способность таких органических красителей к флуоресценции можно включать и выключать с помощью видимого света. Опять же, приложенная интенсивность света может быть довольно низкой (около 100 Вт/см). ²).

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Стефан В. Хелл и Ян Вичманн (1994). «Преодоление предела дифракционного разрешения с помощью стимулированной эмиссии: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированной эмиссии» . Оптические письма . 19 (11): 780–2. Бибкод : 1994OptL...19..780H . дои : 10.1364/OL.19.000780 . ПМИД 19844443 .
^ Jump up to: ^а ^б Томас А. Клар; Стефан В. Хелл (1999). «Субдифракционное разрешение в флуоресцентной микроскопии дальнего поля» . Оптические письма . 24 (14): 954–956. Бибкод : 1999OptL...24..954K . дои : 10.1364/OL.24.000954 . ПМИД 18073907 .
^ См. также Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию .
^ Стефан В. Хелл (2004). «Стратегия оптического изображения и письма в дальней зоне без дифракционного предела». Буквы по физике А. 326 (1–2): 140–145. Бибкод : 2004PhLA..326..140H . doi : 10.1016/j.physleta.2004.03.082 .
^ Райнер Хайнцманн; Томас М. Джовин; Кристоф Кремер (2002). «Микроскопия с насыщенным узором возбуждения - концепция улучшения оптического разрешения» . Журнал Оптического общества Америки А. 19 (8): 1599–2109. Бибкод : 2002JOSAA..19.1599H . дои : 10.1364/JOSAA.19.001599 . hdl : 11858/00-001M-0000-0029-2C24-9 . ПМИД 12152701 .
^ Матс Г.Л. Густавссон (2005). «Нелинейная микроскопия со структурированным освещением: флуоресцентная визуализация в широком поле с теоретически неограниченным разрешением» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (37): 13081–6. Бибкод : 2005PNAS..10213081G . дои : 10.1073/pnas.0406877102 . ПМК 1201569 . ПМИД 16141335 .
^ Михаэль Хофманн; Кристиан Эггелинг; Стефан Якобс; Стефан В. Хелл (2005). «Преодоление дифракционного барьера во флуоресцентной микроскопии при низкой интенсивности света с помощью обратимо фотопереключаемых белков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (49): 17565–9. Бибкод : 2005PNAS..10217565H . дои : 10.1073/pnas.0506010102 . ПМЦ 1308899 . ПМИД 16314572 .
^ Ульрика Бём; Стефан В. Хелл; Роман Шмидт (2016). «4Pi-RESOLFT-наноскопия» . Природные коммуникации . 7 (10504): 1–8. Бибкод : 2016NatCo...710504B . дои : 10.1038/ncomms10504 . ПМК 4740410 . ПМИД 26833381 .
^ Мариано Босси; Йонас Фёллинг; Маркус Дайба; Фолькер Вестфаль; Стефан В. Хелл (2006). «Преодоление барьера дифракционного разрешения в микроскопии дальнего поля за счет молекулярной оптической бистабильности» . Новый журнал физики . 8 (11): 275. Бибкод : 2006NJPh....8..275B . дои : 10.1088/1367-2630/11.08.275 .
^ Дживун Квон; Джихи Хван; Джеван Парк; Ги Рим Хан; Кю Ён Хан; Сон Гын Ким (2015). «RESOLFT-наноскопия с фотопереключаемыми органическими флуорофорами» . Научные отчеты . 5 : 17804. Бибкод : 2015NatSR...517804K . дои : 10.1038/srep17804 . ПМК 4671063 . ПМИД 26639557 .

[STED-sources-1-1] Jump up to: ^а ^б Стефан В. Хелл и Ян Вичманн (1994). «Преодоление предела дифракционного разрешения с помощью стимулированной эмиссии: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированной эмиссии» . Оптические письма . 19 (11): 780–2. Бибкод : 1994OptL...19..780H . дои : 10.1364/OL.19.000780 . ПМИД 19844443 .

[STED-sources-2-2] Jump up to: ^а ^б Томас А. Клар; Стефан В. Хелл (1999). «Субдифракционное разрешение в флуоресцентной микроскопии дальнего поля» . Оптические письма . 24 (14): 954–956. Бибкод : 1999OptL...24..954K . дои : 10.1364/OL.24.000954 . ПМИД 18073907 .

[3] См. также Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию .

[4] Стефан В. Хелл (2004). «Стратегия оптического изображения и письма в дальней зоне без дифракционного предела». Буквы по физике А. 326 (1–2): 140–145. Бибкод : 2004PhLA..326..140H . doi : 10.1016/j.physleta.2004.03.082 .

[5] Райнер Хайнцманн; Томас М. Джовин; Кристоф Кремер (2002). «Микроскопия с насыщенным узором возбуждения - концепция улучшения оптического разрешения» . Журнал Оптического общества Америки А. 19 (8): 1599–2109. Бибкод : 2002JOSAA..19.1599H . дои : 10.1364/JOSAA.19.001599 . hdl : 11858/00-001M-0000-0029-2C24-9 . ПМИД 12152701 .

[6] Матс Г.Л. Густавссон (2005). «Нелинейная микроскопия со структурированным освещением: флуоресцентная визуализация в широком поле с теоретически неограниченным разрешением» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (37): 13081–6. Бибкод : 2005PNAS..10213081G . дои : 10.1073/pnas.0406877102 . ПМК 1201569 . ПМИД 16141335 .

[7] Михаэль Хофманн; Кристиан Эггелинг; Стефан Якобс; Стефан В. Хелл (2005). «Преодоление дифракционного барьера во флуоресцентной микроскопии при низкой интенсивности света с помощью обратимо фотопереключаемых белков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (49): 17565–9. Бибкод : 2005PNAS..10217565H . дои : 10.1073/pnas.0506010102 . ПМЦ 1308899 . ПМИД 16314572 .

[8] Ульрика Бём; Стефан В. Хелл; Роман Шмидт (2016). «4Pi-RESOLFT-наноскопия» . Природные коммуникации . 7 (10504): 1–8. Бибкод : 2016NatCo...710504B . дои : 10.1038/ncomms10504 . ПМК 4740410 . ПМИД 26833381 .

[9] Мариано Босси; Йонас Фёллинг; Маркус Дайба; Фолькер Вестфаль; Стефан В. Хелл (2006). «Преодоление барьера дифракционного разрешения в микроскопии дальнего поля за счет молекулярной оптической бистабильности» . Новый журнал физики . 8 (11): 275. Бибкод : 2006NJPh....8..275B . дои : 10.1088/1367-2630/11.08.275 .

[10] Дживун Квон; Джихи Хван; Джеван Парк; Ги Рим Хан; Кю Ён Хан; Сон Гын Ким (2015). «RESOLFT-наноскопия с фотопереключаемыми органическими флуорофорами» . Научные отчеты . 5 : 17804. Бибкод : 2015NatSR...517804K . дои : 10.1038/srep17804 . ПМК 4671063 . ПМИД 26639557 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]