Количественный ПЦР-прибор

Количественный инструмент ПЦР ^{[ 1 ]} это машина, которая усиливает и обнаруживает ДНК . Он сочетает в себе функции термоциклера и флуориметра , позволяя проводить процесс количественной ПЦР .

Первая машина для количественной ПЦР была описана в 1993 году. ^{[ 2 ]} и две коммерческие модели стали доступны в 1996 году. К 2009 году семь разных производителей предлагали восемнадцать различных моделей. ^{[ 3 ]} Цены варьируются от около 4300 долларов США. ^{[ 4 ]} до 150 000 долларов США ^{[ 5 ]}

Основными характеристиками инструментов количественной ПЦР являются термоконтроль, флуориметрия и пропускная способность образцов.

Термоконтроль

Эффективное проведение количественной ПЦР требует быстрого и точного термоконтроля.

30 циклов ПЦР менее чем за 10 минут. Было продемонстрировано ^{[ 6 ]} Быстрый цикл дает несколько преимуществ, в том числе сокращение времени получения результата, увеличение пропускной способности системы и улучшение специфичности реакции. ^{[ 7 ]} Однако на практике инженерный компромисс между простотой использования, однородностью температуры и скоростью означает, что время реакции обычно превышает 25 минут. ^{[ 3 ]}

Термическая неравномерность во время циклического изменения температуры способствует изменчивости результатов ПЦР. ^{[ 8 ]}^{[ 9 ]}^{[ 10 ]} и, к сожалению, некоторые термоциклеры не соответствуют характеристикам, заявленным производителями. ^{[ 11 ]} Увеличение скорости термоциклирования обычно снижает температурную однородность и может снизить точность количественной ПЦР . ^{[ 12 ]}

Однородность температуры также оказывает прямое влияние на способность различать различные продукты ПЦР при выполнении анализа температуры плавления. ^{[ 13 ]} Помимо однородности, разрешение, с которым приборы могут контролировать температуру, является фактором, влияющим на их производительность при выполнении анализа плавления с высоким разрешением . ^{[ 14 ]}

Таким образом, скорость, точность и однородность термоконтроля являются важными характеристиками инструментов количественной ПЦР.

Флуориметрия

Приборы для количественной ПЦР контролируют ход ПЦР и природу амплифицированных продуктов путем измерения флуоресценции .

Диапазон различных флуоресцентных меток, которые можно контролировать, точность, с которой их можно измерить, а также способность различать сигналы от разных меток являются важными эксплуатационными характеристиками.

Используя прибор с достаточным количеством оптических каналов и обширной оптимизацией анализа, можно одновременно определить количество до 7 отдельных мишеней в одной реакции ПЦР. ^{[ 15 ]} Однако даже при обширной оптимизации эффективный динамический диапазон таких мультиплексных анализов часто снижается из-за интерференции между составляющими реакциями. ^{[ 16 ]}

Шум при измерениях флуоресценции влияет на точность qPCR. Обычно это функция изменения интенсивности источника возбуждения, шума детектора и механического шума. Многофакторный анализ показал, что вклад механического шума является наиболее важным фактором и что системы без движущихся частей на оптических путях, вероятно, обеспечат повышенную количественную точность. ^{[ 10 ]}

Кроме того, при выполнении анализа плавления с высоким разрешением одним из факторов, влияющих на чувствительность гетеродуплексного обнаружения, является флуориметрическая точность. ^{[ 14 ]}

Таким образом, количество оптических каналов и уровень шума при измерениях флуоресценции также являются важными характеристиками инструментов количественной ПЦР .

Ссылки

^ Также иногда называют «прибором для ПЦР в реальном времени».
^ Хигучи, Р.; Доллингер, Г.; Уолш, PS; Гриффит, Р. (1992), «Одновременная амплификация и обнаружение специфических последовательностей ДНК», Bio/Technology , 10 (4): 413–7, doi : 10.1038/nbt0492-413 , PMID 1368485 , S2CID 1684150
^ Jump up to: ^а ^б Логан, Дж.; Эдвардс, К. (январь 2009 г.). «Глава 2. Обзор платформ ПЦР». В Сондерсе, Н. (ред.). ПЦР в реальном времени: современные технологии и приложения . Кайстер Академик Пресс. ISBN 978-1-904455-39-4 .
^ Открытая машина для ПЦР в реальном времени с открытым исходным кодом
^ Ма, Х.; Ши, К.; Чен, Г.; Чен, X.; Чуанг, М. (2006), «Применение полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР)», Журнал американской науки , 2 (3): 1–15.
^ Рагхаван, В.; Уитни, С.; Эбмайер, Р.; Падхе, Н.; Нельсон, М. Вилджоен; Гогос, Г. (2006), «Термический анализ термоциклера на основе вихревой трубки для быстрой амплификации ДНК: экспериментальные и двумерные численные результаты» , Review of Scientific Instruments , 77 (9): 094301–094301–9, Bibcode : 2006RScI ...77i4301R , дои : 10.1063/1.2338283
^ Виттвер, Коннектикут; Гарлинг, DJ (1991), «Быстрая амплификация ДНК: оптимизация времени и температуры», BioTechniques , 10 (1): 76–83, PMID 2003928
^ Ким, Ю.Х.; Ян, И.; Бэ, Ю.С.; Парк, С.Р. (2008), «Оценка производительности термоциклеров для ПЦР в условиях быстрого цикла», BioTechniques , 44 (4): 495–6, doi : 10.2144/000112705 , PMID 18476814
^ Шодер, Д.; Шмальвизер, А.; Шаубергер, Г.; Кун, М.; Хурфар, Дж.; Вагнер, М. (2003), «Физические характеристики шести новых термоциклеров», Clin. хим. , 49 (6): 960–3, doi : 10.1373/49.6.960 , PMID 12765996
^ Jump up to: ^а ^б Ли, Д.-С. (2010). «Моделирование системы машины для ПЦР в реальном времени и систематический подход к надежному проектированию системы ПЦР на чипе в реальном времени» . Датчики . 10 (1): 697–718. Бибкод : 2010Senso..10..697L . дои : 10.3390/s100100697 . ПМК 3270864 . ПМИД 22315563 .
^ Шодер, Д.; Шмальвизер, А.; Шаубергер, Г.; Хурфар, Дж.; Кун, М.; Вагнер, М. (2005), «Новый подход к оценке производительности циклистов ПЦР, используемых для диагностического тестирования», J Clin Microbiol , 43 (6): 2724–8, doi : 10.1128/jcm.43.6.2724-2728.2005 , PMC 1151936 , PMID 15956389
^ Хилшер, К.; Варсон, В.; Диттмер, Д.П. (2005), «Более быстрые протоколы количественной ПЦР в реальном времени могут потерять чувствительность и проявить повышенную вариабельность», Nucleic Acids Res. , 33 (21): e182, doi : 10.1093/nar/gni181 , PMC 1297710 , PMID 16314296
^ Херрманн, М.; Дурчи, Дж.; Виттвер, К.; Фелькердинг, К. (2007). «Расширенное инструментальное сравнение анализа плавления ДНК ампликонов для сканирования мутаций и генотипирования» . Клиническая химия . 53 (8): 1544–1548. дои : 10.1373/clinchem.2007.088120 . ПМИД 17556647 .
^ Jump up to: ^а ^б Гандри, К.; Вандерстин, Дж.; Рид, Г.; Прайор, Р.; Чен, Дж.; Виттвер, К. (2003). «Анализ плавления ампликонов с мечеными праймерами: метод закрытой пробирки для дифференциации гомозигот и гетерозигот» . Клиническая химия . 49 (3): 396–406. дои : 10.1373/49.3.396 . ПМИД 12600951 .
^ Кеппель, Р.; Циммерли, Ф.; Брейтенмозер, А. (2009), «Гептаплексная ПЦР в реальном времени для идентификации и количественного определения ДНК из говядины, свинины, курицы, индейки, конины, овец (баранины) и коз», European Food Research and Technology , 230 : 125 –33, номер doi : 10.1007/s00217-009-1154-5 , S2CID 96340566
^ Бардт, К.; Креч, А.; Вурц, А.; Вульф, Д. (2010). «Валидация недавно разработанного гексаплексного ПЦР в реальном времени для проверки наличия ГМО в пищевых продуктах, кормах и семенах». Аналитическая и биоаналитическая химия . 396 (6): 2103–2112. дои : 10.1007/s00216-009-3380-x . ПМИД 20101506 . S2CID 22657985 .

Внешние ссылки

[1] Также иногда называют «прибором для ПЦР в реальном времени».

[2] Хигучи, Р.; Доллингер, Г.; Уолш, PS; Гриффит, Р. (1992), «Одновременная амплификация и обнаружение специфических последовательностей ДНК», Bio/Technology , 10 (4): 413–7, doi : 10.1038/nbt0492-413 , PMID 1368485 , S2CID 1684150

[Logan_2009-3] Jump up to: ^а ^б Логан, Дж.; Эдвардс, К. (январь 2009 г.). «Глава 2. Обзор платформ ПЦР». В Сондерсе, Н. (ред.). ПЦР в реальном времени: современные технологии и приложения . Кайстер Академик Пресс. ISBN 978-1-904455-39-4 .

[4] Открытая машина для ПЦР в реальном времени с открытым исходным кодом

[5] Ма, Х.; Ши, К.; Чен, Г.; Чен, X.; Чуанг, М. (2006), «Применение полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР)», Журнал американской науки , 2 (3): 1–15.

[6] Рагхаван, В.; Уитни, С.; Эбмайер, Р.; Падхе, Н.; Нельсон, М. Вилджоен; Гогос, Г. (2006), «Термический анализ термоциклера на основе вихревой трубки для быстрой амплификации ДНК: экспериментальные и двумерные численные результаты» , Review of Scientific Instruments , 77 (9): 094301–094301–9, Bibcode : 2006RScI ...77i4301R , дои : 10.1063/1.2338283

[7] Виттвер, Коннектикут; Гарлинг, DJ (1991), «Быстрая амплификация ДНК: оптимизация времени и температуры», BioTechniques , 10 (1): 76–83, PMID 2003928

[8] Ким, Ю.Х.; Ян, И.; Бэ, Ю.С.; Парк, С.Р. (2008), «Оценка производительности термоциклеров для ПЦР в условиях быстрого цикла», BioTechniques , 44 (4): 495–6, doi : 10.2144/000112705 , PMID 18476814

[9] Шодер, Д.; Шмальвизер, А.; Шаубергер, Г.; Кун, М.; Хурфар, Дж.; Вагнер, М. (2003), «Физические характеристики шести новых термоциклеров», Clin. хим. , 49 (6): 960–3, doi : 10.1373/49.6.960 , PMID 12765996

[Lee_2010-10] Jump up to: ^а ^б Ли, Д.-С. (2010). «Моделирование системы машины для ПЦР в реальном времени и систематический подход к надежному проектированию системы ПЦР на чипе в реальном времени» . Датчики . 10 (1): 697–718. Бибкод : 2010Senso..10..697L . дои : 10.3390/s100100697 . ПМК 3270864 . ПМИД 22315563 .

[11] Шодер, Д.; Шмальвизер, А.; Шаубергер, Г.; Хурфар, Дж.; Кун, М.; Вагнер, М. (2005), «Новый подход к оценке производительности циклистов ПЦР, используемых для диагностического тестирования», J Clin Microbiol , 43 (6): 2724–8, doi : 10.1128/jcm.43.6.2724-2728.2005 , PMC 1151936 , PMID 15956389

[12] Хилшер, К.; Варсон, В.; Диттмер, Д.П. (2005), «Более быстрые протоколы количественной ПЦР в реальном времени могут потерять чувствительность и проявить повышенную вариабельность», Nucleic Acids Res. , 33 (21): e182, doi : 10.1093/nar/gni181 , PMC 1297710 , PMID 16314296

[Herrmann_2007-13] Херрманн, М.; Дурчи, Дж.; Виттвер, К.; Фелькердинг, К. (2007). «Расширенное инструментальное сравнение анализа плавления ДНК ампликонов для сканирования мутаций и генотипирования» . Клиническая химия . 53 (8): 1544–1548. дои : 10.1373/clinchem.2007.088120 . ПМИД 17556647 .

[Gundry_2003-14] Jump up to: ^а ^б Гандри, К.; Вандерстин, Дж.; Рид, Г.; Прайор, Р.; Чен, Дж.; Виттвер, К. (2003). «Анализ плавления ампликонов с мечеными праймерами: метод закрытой пробирки для дифференциации гомозигот и гетерозигот» . Клиническая химия . 49 (3): 396–406. дои : 10.1373/49.3.396 . ПМИД 12600951 .

[15] Кеппель, Р.; Циммерли, Ф.; Брейтенмозер, А. (2009), «Гептаплексная ПЦР в реальном времени для идентификации и количественного определения ДНК из говядины, свинины, курицы, индейки, конины, овец (баранины) и коз», European Food Research and Technology , 230 : 125 –33, номер doi : 10.1007/s00217-009-1154-5 , S2CID 96340566

[16] Бардт, К.; Креч, А.; Вурц, А.; Вульф, Д. (2010). «Валидация недавно разработанного гексаплексного ПЦР в реальном времени для проверки наличия ГМО в пищевых продуктах, кормах и семенах». Аналитическая и биоаналитическая химия . 396 (6): 2103–2112. дои : 10.1007/s00216-009-3380-x . ПМИД 20101506 . S2CID 22657985 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]