Аффинная хроматография с красителем и лигандом
Аффинная хроматография с красителем и лигандом — один из методов аффинной хроматографии, используемый для очистки белков из сложной смеси. Подобно общей хроматографии, но использование красителей для нанесения на опорную матрицу колонки в качестве стационарной фазы, которая позволяет связываться ряду белков со схожими активными центрами, называется псевдоаффинностью. [ 1 ] Синтетические красители используются для имитации связывания субстратов или кофакторов с активными центрами белков, которые можно дополнительно усилить для нацеливания на более специфические белки. Затем следует промывание, процесс удаления других нецелевых молекул, а затем элюирование целевых белков путем изменения pH или манипулирования концентрацией соли. Колонку можно использовать многократно благодаря стабильности иммобилизованных красителей. Его можно проводить обычным способом, используя насадочную колонку или колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). [ 2 ]
Открытие
[ редактировать ]Открытие способности красителя к лиганду связано с синим красителем, называемым синим декстраном. Синий краситель используется в качестве маркера объема пустот (V 0 ) для гель-фильтрационной колонки. Было показано, что краситель обладает свойством связываться с некоторыми определенными белками, такими как пируваткиназа, и элюироваться вместе с пустым объемом. Позже было обнаружено, что за взаимодействие с белками отвечает «цибакроновый синий FG3-A», реактивная связь красителя с декстраном. [ 1 ] [ 2 ]
Иммобилизация красителя
[ редактировать ]
Красители эффективно иммобилизуются на матрице колонки, поскольку обычно красители связаны с монохлортриазиновым или дихлортриазиновым кольцом ( триазиновый краситель). Этот тип красителей особенно хорошо работает на основе матрицы с гидроксильной группой . [ 3 ] Обычно используемая поддерживающая матрица представляет собой сшитую агарозу (сефарозу), сефадекс, полиакриламид и диоксид кремния.
Примером иммобилизации триазиновой связи является синяя сефароза, полученная из Cibacron blue FG3-A с монохлортриазином, ковалентно связанным с OH-группой сефарозы. В результате этой реакции образуется эфирная связь, а также хлористый водород. [ 4 ]
C 29 H 20 ClN 7 O 11 S 3 + C 24 H 38 O 19 → C 53 H 57 N 7 O 30 S 3 + HCl
Цибакрон синий FG3-A + сефароза → синяя сефароза + HCl
Реактивные красители
[ редактировать ]Красители, используемые в этом типе хроматографии, недороги и обычно доступны, поскольку их производят в текстильной промышленности и называют реактивными красителями . Он содержит хромофоры, которые часто присоединены к триазиновому кольцу. В текстильной промышленности реактивные красители используются для окрашивания таких материалов, как хлопок, который представляет собой целлюлозу.
Обычно используемые реактивные красители для хроматографии можно разделить по названию их показателя цвета или функциональной группе. Отмечено, что у каждой компании разные торговые названия и немного разные формулы активных красителей. Обычно коммерчески доступны с сефарозой в качестве поддерживающей матрицы в виде насадочных колонок.
Синие реактивные красители
[ редактировать ]Сибакрон Синий F3GA
[ редактировать ]Цибакрон Синий F3GA, Процион Синий HB или Реактивный синий 2 являются антагонистами пуринергических рецепторов , таких как пуринорецептор P2Y, а также антагонистом рецепторных каналов АТФ. Он имеет формулу C 29 H 20 ClN 7 O 11 S 3 и молекулярную массу 774,2 г/моль. [ 5 ] Цибакроновый синий растворим в воде и ДМСО, но нерастворим в этаноле. В воде насыщенная концентрация достигается при 12,92 мМ с помощью обработки ультразвуком. Cibacron Blue F3GA обладает широкой специфичностью к нуклеотидсвязывающим белкам или просто стереоселективностью электростатического связывания. Его можно использовать для очистки интерферонов, дегидрогеназ, киназ и сывороточного альбумина. Например, очистка интерферона из экстракта фибробластов десны человека с использованием Cibacron Blue F3G-A на поли(2-гидроксиэтилметакрилате), несущей матрице, в форме криогелей. Он показал чистоту интерферона 97,6%. [ 6 ]
Синий MX-R
[ редактировать ]Blue MX-R или Reactive Blue 4 имеет формулу C 23 H 14 Cl 2 N 6 O 8 S 2 и молекулярную массу 637,4 г/моль. В отличие от Cibacron Blue F3GA, он содержит дихлортриазиновое кольцо в хромофоре. Для крупномасштабной очистки белков Blue MX-R можно использовать для очистки белков, таких как лактатдегидрогеназа (ЛДГ). [ 2 ] При быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC) с использованием Blue MX-R, иммобилизованного на шариках из поли(глицидилметакрилата-со-этилендиметакрилата), было обнаружено разделение лизоцима и бычьего сывороточного альбумина (BSA), очищенного лизоцима от куриного альбумина. [ 7 ]
Красные реактивные красители
[ редактировать ]Красный HE-3B
[ редактировать ]Red HE-3B или Reactive Red 120 имеет формулу C 44 H 30 Cl 2 N 14 O 20 S 6 и молекулярную массу 1338,1 г/моль, содержит два монохлортриазиновых кольца. Он хорошо растворим в воде. [ 8 ] Способность Red HE-3B связывать дегидрогеназы выше для НАДФ+-зависимых дегидрогеназ, чем для НАД+-зависимых дегидрогеназ, и наоборот для Cibacron Blue F3G-A. [ 9 ] Его можно использовать для очистки энтеротоксинов A, B и C 2 из Staphylococcus aureus с использованием Procion Red HE-3B на сефарозе, элюируя 60 мМ и 150 мМ фосфата. [ 10 ]
Желтые реактивные красители
[ редактировать ]Желтый ГА
[ редактировать ]Желтый HA или реактивный желтый 3 имеет формулу C 21 H 17 ClN 8 O 7 S 2 и молекулярную массу 593 г/моль, содержит монохлортриазиновое кольцо. Было замечено, что на агарозе в качестве поддерживающей матрицы очищается белок-переносчик эфира холестерина. [ 11 ]
Коричневые реактивные красители
[ редактировать ]Коричневый MX-5BR
[ редактировать ]Brown MX-5BR или Reactive Brown 10 имеет формулу C 40 H 19 Cl 4 CrN 12 Na 2 O 12 S 2 и молекулярную массу 1163,6 г/моль, содержит два дихлортриазиновых кольца. [ 12 ] Например, Brown MX-5BR можно использовать для очистки лизоцима, фосфинотрицинацетилтрансферазы. [ 13 ] Было также показано, что он может элюировать триптофанил-тРНК-синтетазу, используя Trp в качестве элюента, однако триптофанил-тРНК и тирозил-тРНК-синтетаза являются единственными т-РНК, которые можно элюировать с помощью Brown MX-5BR. [ 14 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б МакГеттрик, Энн; Уорролл, Маргарет (2004). «Аффинная хроматография краситель-лиганд». Протоколы очистки белков . Методы молекулярной биологии. Том. 244. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. стр. 151–7. дои : 10.1385/1-59259-655-x:151 . ISBN 978-1-59259-655-3 . ПМИД 14970553 .
- ^ Jump up to: а б с Сюй, Джеймс; Бойер, Филип (1993). «Очистка белков с помощью хроматографии на красителе-лиганде» (PDF) . Достижения в области биохимической инженерии/биотехнологии . 49 . Спрингер: 1–44. дои : 10.1007/BFb0046571 . ISBN 978-3-540-56440-9 . ПМИД 8368124 . Проверено 14 февраля 2021 г.
- ^ Денизли, Адиль; Пишкин, Эрхан (30 октября 2001 г.). «Системы сродства краситель-лиганд». Журнал биохимических и биофизических методов . 49 (1–3): 391–416. дои : 10.1016/s0165-022x(01)00209-3 . ПМИД 11694290 .
- ^ Лоуэр, Кристофер Р.; Пирсон, Джеймс К. (1984). «Аффинная хроматография на иммобилизованных красителях». Часть C: Ферментативная очистка и связанные с ней методы . Методы энзимологии. Том. 104. С. 97–113. дои : 10.1016/S0076-6879(84)04085-4 . ISBN 9780121820046 . ПМИД 6144035 .
- ^ «Сводка соединений PubChem для CID 656725, реактивный синий 2» . Паб Хим . Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 12 марта 2021 г.
- ^ Доган, Али; Озкара, Серпиль; Сари, Мюфреттин; Узун, Локман; Денизли, Адиль (2012). «Оценка эффективности адсорбции человеческого интерферона криогелями с Cibacron Blue F3GA и очистка интерферона с использованием системы FPLC». Журнал хроматографии Б. 893–894: 69–76. дои : 10.1016/j.jchromb.2012.02.036 . ПМИД 22445306 .
- ^ Ву, Фейян; Чжу, Ян; Цзя, Чжишен (2006). «Получение аффинных хроматографических насадок краситель-лиганд на основе монодисперсных поли(глицидилметакрилат-со-этилендиметакрилата) шариков и их хроматографические свойства». Дж Хроматогр А. 1134 (1–2): 45–50. дои : 10.1016/j.chroma.2006.07.087 . ПМИД 17034800 .
- ^ «Сводка соединений PubChem для CID 73264, реактивный красный 120» . Паб Хим . Национальный центр биотехнологической информации.
- ^ Уотсон, Д.Х.; Харви, MJ; Дин, PDG (1978). «Селективное замедление НАДФ+-зависимых дегидрогеназ иммобилизованным проионом красного HE-3B» . Биохимический журнал . 173 (2): 591–596. дои : 10.1042/bj1730591 . ISSN 0264-6021 . ПМЦ 1185813 . ПМИД 29603 .
- ^ Брем, РД; Трантер, HS; Хэмблтон, П; Меллинг, Дж (1990). «Крупномасштабная очистка стафилококковых энтеротоксинов A, B и C2 методом аффинной хроматографии с красителем-лигандом» . Прикладная и экологическая микробиология . 56 (4): 1067–72. Бибкод : 1990ApEnM..56.1067B . doi : 10.1128/aem.56.4.1067-1072.1990 . ЧВК 184344 . ПМИД 2339869 .
- ^ «Сводка соединений PubChem для CID 78686» . Паб Хим . Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 14 марта 2021 г.
- ^ «Сводка соединений PubChem для CID 3081425, Procion Brown MX 5BR» . Паб Хим . Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 14 марта 2021 г.
- ^ Ван, К; Ли, ТК; Кроули, Канзас; Белл, Э (2013). «Очистка фосфинотрицинацетилтрансферазы с использованием сродства Reactive Brown 10 за одну стадию хроматографии». Экспрессия и очистка белков . 90 (2): 129–34. дои : 10.1016/j.pep.2013.05.011 . ПМИД 23748142 .
- ^ Аткинсон, Т; Хаммонд, премьер-министр; ХАРТВЕЛЛ, РД; ХЬЮЗ, П; СКЭУЭН, доктор медицины; ШЕРВУД, РФ; МАЛЫЙ, ДА; БРУТОН, CJ; ХАРВИ, MJ; ЛОУ, CR (1981). «Аффинная хроматография с триазиновым красителем». Биохим Соц Транс . 9 (4): 290–3. дои : 10.1042/bst0090290 . ПМИД 7262447 .