snRNA-seq
snRNA-seq , также известный как секвенирование одноядерной РНК , секвенирование одноядерной РНК или sNuc-seq , представляет собой метод секвенирования РНК для профилирования экспрессии генов в клетках , которые трудно изолировать, например, в тканях, которые заархивированы или являются твердыми. быть диссоциированным. Это альтернатива секвенированию одноклеточной РНК (scRNA-seq) , поскольку он анализирует ядра , а не интактные клетки.
snRNA-seq сводит к минимуму возникновение ложной экспрессии генов, поскольку локализация полностью зрелых рибосом в цитоплазме означает, что любые мРНК факторов транскрипции , которые экспрессируются после процесса диссоциации, не могут быть транслированы и, следовательно, их нижестоящие мишени не могут быть транскрибированы. [ 1 ] Кроме того, технология snRNA-seq позволяет открывать новые типы клеток, которые в противном случае было бы трудно изолировать.
Методы и технология
[ редактировать ]Базовый метод секвенирования мяРНК требует 4 основных этапов: обработка ткани, выделение ядер, сортировка клеток и секвенирование. Чтобы выделить и секвенировать РНК внутри ядра, snRNA-seq включает использование быстрого и мягкого протокола ядерной диссоциации. Этот протокол позволяет свести к минимуму технические проблемы, которые могут повлиять на исследования, особенно те, которые касаются немедленного раннего поведения генов (IEG).
Полученные диссоциированные клетки суспендируют и суспензию осторожно лизируют, позволяя отделить ядра клеток от их цитоплазматических лизатов с помощью центрифугирования. [ 2 ] Эти разделенные ядра/клетки сортируются с использованием сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), в отдельные лунки и амплифицируются с использованием микрофлюидного оборудования. [ 2 ] Секвенирование происходит в обычном режиме, и данные можно анализировать при необходимости. Эта базовая методология секвенирования мяРНК способна определять профили РНК из тканей, которые сохранились или не могут быть диссоциированы, но она не обладает высокой пропускной способностью из-за того, что полагается на сортировку ядер с помощью FACS. [ 3 ] Этот метод невозможно легко масштабировать для профилирования большого количества ядер или образцов. Существуют массовые параллельные методы секРНК-секвенирования, которые можно легко масштабировать, но их требование использования суспензии одной клетки в качестве входных данных не является идеальным и исключает некоторую гибкость, доступную методу секвенирования мяРНК в отношении типов тканей и клеток, которые можно осмотреть. [ 3 ] В ответ на это исследователями из Института Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда был разработан метод DroNc-Seq массового параллельного секвенирования мяРНК с использованием капельной технологии. [ 3 ] В этом методе ядра, выделенные из фиксированной или замороженной ткани, инкапсулируются в капли с шариками с уникальным штрих-кодом, покрытыми олигонуклеотидами, содержащими 30-концевой участок дезокситимина (dT). [ 4 ] Это покрытие улавливает содержимое полиаденилированной мРНК, образующейся при лизисе ядер внутри капель. [ 4 ] Захваченная мРНК подвергается обратной транскрипции в кДНК после разрушения эмульсии. [ 4 ] Секвенирование этой кДНК дает транскриптомы всех рассматриваемых отдельных ядер, и их можно использовать для многих целей, включая идентификацию уникальных типов клеток. [ 5 ]
Инструменты и оборудование для секвенирования, используемые при секвенировании scRNA, можно использовать с модификациями для экспериментов по секвенированию snRNA. Illumina описывает рабочий процесс базового метода секвенирования мяРНК, который можно выполнить с помощью существующего оборудования. [ 2 ] DroNc-Seq можно выполнить с помощью микрофлюидных платформ, предназначенных для метода Drop-seq scRNA-seq. Однако компания Dolomite Bio адаптировала один из своих инструментов, автоматизированную платформу Nadia для секРНК-секвенирования, для использования также и в DroNc-Seq. [ 5 ] Этот инструмент может упростить создание библиотек секвенирования отдельных ядер, поскольку он используется по назначению.
Что касается анализа данных после секвенирования, в лаборатории МакКэрролла в Гарварде был разработан вычислительный конвейер, известный как dropSeqPipe. [ 6 ] Хотя конвейер изначально был разработан для использования с данными Drop-seq scRNA-seq, его можно использовать с данными DroNc-Seq, поскольку он также использует капельную технологию.
Разница между snRNA-seq и scRNA-seq
[ редактировать ]snRNA-seq использует изолированные ядра вместо целых клеток для профилирования экспрессии генов. Другими словами, scRNA-seq измеряет как цитоплазматические, так и ядерные транскрипты, тогда как snRNA-seq в основном измеряет ядерные транскрипты (хотя некоторые транскрипты могут быть прикреплены к шероховатой эндоплазматической сети и частично сохранены в ядерных препаратах). [ 7 ] Это позволяет snRNA-seq обрабатывать только ядро, а не всю клетку. По этой причине, по сравнению с scRNA-seq, snRNA-Seq более подходит для профилирования экспрессии генов в клетках, которые трудно изолировать (например, адипоциты, нейроны), а также в сохранившихся тканях. [ 5 ]
Кроме того, ядра, необходимые для секвенирования мяРНК, можно быстро и легко получить из свежих, слегка фиксированных или замороженных тканей, тогда как выделение отдельных клеток для секвенирования одноклеточной РНК (scРНК-секвенирования) предполагает длительную инкубацию и обработку. Это дает исследователям возможность получать транскриптомы, которые не так сильно повреждаются во время изоляции.
Приложение
[ редактировать ]В нейробиологии нейроны имеют взаимосвязанную природу, из-за чего чрезвычайно сложно изолировать неповрежденные отдельные нейроны. [ 8 ] Поскольку snRNA-seq стал альтернативным методом оценки транскриптома клетки путем выделения отдельных ядер, стало возможным проводить исследования отдельных нейронов из посмертной ткани головного мозга человека. [ 9 ] snRNA-seq также позволил провести первый однонейронный анализ немедленной ранней экспрессии генов (IEG), связанной с формированием памяти в гиппокампе мыши. [ 1 ] В 2019 году Дмитрий и др. использовали этот метод на кортикальной ткани пациентов с РАС для выявления транскриптомных изменений, связанных с РАС, в определенных типах клеток, что является первой оценкой транскриптома, специфичной для конкретного типа клеток, в мозге, пораженном РАС. [ 10 ]
Помимо нейробиологии, snRNA-seq также использовался в других областях исследований. В 2019 году Haojia et al сравнили секвенирование scRNA и секвенирование snRNA в геномном исследовании почек. Они обнаружили, что snRNA-seq обеспечивает эквивалентную скорость обнаружения генов, что и scRNA-seq в почках взрослого человека, с несколькими существенными преимуществами (включая совместимость с замороженными образцами, снижение систематической ошибки диссоциации и т. д.). [ 11 ] В 2019 году Джоши и др. использовали snRNA-seq в исследовании биологии легких человека, в ходе которого они обнаружили, что snRNA-seq позволяет беспристрастно идентифицировать типы клеток из замороженных здоровых и фиброзированных тканей легких. [ 12 ] Ткани сердца взрослых млекопитающих чрезвычайно трудно диссоциировать без повреждения клеток, что не позволяет легко секвенировать ткань. Однако в 2020 году немецкие ученые представили первый отчет о секвенировании сердца взрослых млекопитающих с использованием snRNA-seq и смогли предоставить практическое распределение типов клеток в сердце. [ 13 ]
Плюсы и минусы snRNA-seq
[ редактировать ]Плюсы
[ редактировать ]- При секРНК-секвенировании процесс диссоциации может повредить некоторые чувствительные клетки и некоторые клетки в определенных тканях (например, коллагеновый матрикс). [ 11 ] ) может быть чрезвычайно трудно диссоциировать. Такие проблемы можно предотвратить при секвенировании мяРНК, поскольку нам нужно изолировать только одно ядро, а не целую отдельную клетку.
- В отличие от scRNA-seq, snRNA-seq имеет быстрые и мягкие протоколы диссоциации ядер, которые предотвратят технические проблемы, возникающие при нагревании и расщеплении протеазой. [ 2 ]
- snRNA-seq очень хорошо работает для консервированных/замороженных тканей. [ 5 ]
Минусы
[ редактировать ]- Секвенирование РНК в цитоплазме (изоформы генов, РНК в митохондриях, хлоропластах и т. д.) невозможно, поскольку snRNA-seq в основном измеряет ядерные транскрипты.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Лакар, Бенджамин; Линкер, Сара Б.; Егер, Батист Н.; Кришнасвами, Сугуна; Бэррон, Джерика; Келдер, Мартин; Парилак, Сара; Пакуола, Апуан; Венепалли, Пратап; Новотный, Марк; О'Коннор, Кэролайн (19 апреля 2016 г.). «Секвенирование ядерной РНК отдельных нейронов выявляет молекулярные признаки активации» . Природные коммуникации . 7 : 11022. Бибкод : 2016NatCo...711022L . дои : 10.1038/ncomms11022 . ISSN 2041-1723 . ПМЦ 4838832 . ПМИД 27090946 .
- ^ Jump up to: а б с д «мяРНК-Seq» . www.illumina.com . Проверено 28 февраля 2020 г.
- ^ Jump up to: а б с Хабиб, Наоми; Авраам-Давиди, Инбал; Басу, Аниндита; Беркс, Тайлер; Шекхар, Картик; Хофри, Матан; Чоудхури, Сурав Р.; Аге, Франсуа; Гельфанд, Эллен; Ардли, Кристин; Вайц, Дэвид А. (октябрь 2017 г.). «Массовое параллельное секвенирование одноядерной РНК с DroNc-seq» . Природные методы . 14 (10): 955–958. дои : 10.1038/nmeth.4407 . ISSN 1548-7105 . ПМЦ 5623139 . ПМИД 28846088 .
- ^ Jump up to: а б с Ф, Дж (7 ноября 2018 г.). «Высокопроизводительный анализ транскриптомов одиночных ядер с помощью инструмента Nadia компании Dolomite Bio» (PDF) . Доломит Био . Проверено 27 февраля 2020 г.
- ^ Jump up to: а б с д Био, Доломит. «Одноядерная РНК-Seq (sNuc-Seq)» . Доломит Био . Проверено 27 февраля 2020 г.
- ^ Макоско, Эван З.; Басу, Аниндита; Сатиджа, Рахул; Немеш, Джеймс; Шекхар, Картик; Гольдман, Мелисса; Тирош, Итай; Биалас, Эллисон Р.; Камитаки, Нолан; Мартерстек, Эмили М.; Тромбетта, Джон Дж. (21 мая 2015 г.). «Высокопараллельное полногеномное профилирование экспрессии отдельных клеток с использованием нанолитровых капель» . Клетка . 161 (5): 1202–1214. дои : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . ISSN 0092-8674 . ПМЦ 4481139 . ПМИД 26000488 .
- ^ Баккен, Трюгве Э.; Ходж, Ребекка Д.; Миллер, Джереми А.; Яо, Цзычжэнь; Нгуен, Тхук Нги; Аверманн, Брайан; Баркан, Элиза; Бертаньолли, Даррен; Каспер, Тамара; Ди, Ник; Гаррен, Эмма (26 декабря 2018 г.). «Одноядерные и одноклеточные транскриптомы в сравнении в совпадающих типах корковых клеток» . ПЛОС ОДИН . 13 (12): e0209648. Бибкод : 2018PLoSO..1309648B . дои : 10.1371/journal.pone.0209648 . ISSN 1932-6203 . ПМК 6306246 . ПМИД 30586455 .
- ^ Озеро, Блю Б.; Коделуппи, Симона; Юнг, Юн К.; Гао, Дерек; Чун, Джерольд; Харченко Петр Владимирович; Линнарссон, Стен; Чжан, Кун (20 июля 2017 г.). «Сравнительная стратегия для одноядерных и одноклеточных транскриптомов подтверждает точность прогнозируемой экспрессии клеточного типа из ядерной РНК» . Научные отчеты . 7 (1): 6031. Бибкод : 2017NatSR...7.6031L . дои : 10.1038/s41598-017-04426-w . ISSN 2045-2322 . ПМК 5519641 . ПМИД 28729663 .
- ^ Кришнасвами, Сугуна Рани; Гриндберг, Рашель В.; Новотный, Марк; Венепалли, Пратап; Лакар, Бенджамин; Бутани, Кунал; Линкер, Сара Б.; Фам, Сон; Эрвин, Дженнифер А.; Миллер, Джереми А.; Ходж, Ребекка (март 2016 г.). «Использование отдельных ядер для секвенирования РНК для захвата транскриптома посмертных нейронов» . Протоколы природы . 11 (3): 499–524. дои : 10.1038/нпрот.2016.015 . ISSN 1750-2799 . ПМК 4941947 . ПМИД 26890679 .
- ^ Вельмешев Дмитрий; Ширмер, Лукас; Юнг, Дайан; Хойсслер, Максимилиан; Перес, Йонатан; Майер, Симона; Бхадури, Апарна; Гоял, Ниташа; Рович, Дэвид Х.; Кригштейн, Арнольд Р. (17 мая 2019 г.). «Одноклеточная геномика выявляет молекулярные изменения, специфичные для типа клеток при аутизме» . Наука . 364 (6441): 685–689. Бибкод : 2019Sci...364..685V . дои : 10.1126/science.aav8130 . ISSN 0036-8075 . ПМЦ 7678724 . ПМИД 31097668 . S2CID 156055368 .
- ^ Jump up to: а б Ву, Хаоцзя; Кирита, Юхей; Доннелли, Эринн Л.; Хамфрис, Бенджамин Д. (январь 2019 г.). «Преимущества одноядерного секвенирования по сравнению с одноклеточным РНК почек взрослых: редкие типы клеток и новые состояния клеток, выявленные при фиброзе» . Журнал Американского общества нефрологов . 30 (1): 23–32. дои : 10.1681/ASN.2018090912 . ISSN 1046-6673 . ПМК 6317600 . ПМИД 30510133 .
- ^ Джоши, Н.; Ватанабэ, С.; Рейфман, Пенсильвания; Бхарат, А.; Будингер, Гс; Мишарин А. (01 мая 2019 г.), «Секвенирование одноядерной РНК для объективного подсчета типов клеток в архивных замороженных тканях легких человека», D29. ЛЕГКИЕ МУЛЬТИОМИКА К МЕХАНИЗМУ , Тезисы Международной конференции Американского торакального общества, Американское торакальное общество, стр. A6077, doi : 10.1164/ajrccm-conference.2019.199.1_meetingabstracts.a6077 , S2CID 202858688
- ^ Вулфиен, Маркус; Галоу, Анн-Мари; Мюллер, Паула; Барч, Мадлен; Бруннер, Рональд М.; Голдаммер, Том; Волькенхауэр, Олаф; Хефлих, Андреас; Дэвид, Роберт (февраль 2020 г.). «Одноядерное секвенирование всего сердца млекопитающих: клеточный состав и скорость» . Клетки . 9 (2): 318. doi : 10.3390/cells9020318 . ПМЦ 7072447 . ПМИД 32013057 .