Стандарты стабильных изотопов и захват антипептидными антителами
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти сообщения )
|
Стандарты стабильных изотопов и захват антипептидными антителами ( SISCAPA ) — это метод масс-спектрометрии для измерения количества белка в биологическом образце. [ 1 ]
История
[ редактировать ]Внедренный в 2004 году метод использовался в различных исследованиях в области протеомики , а также при клинических анализах крови в референс-лабораториях и сочетает в себе преимущества масс-спектрометрии с преимуществами традиционных иммуноанализов . [ 2 ] SISCAPA используется для измерения конкретных предварительно выбранных белков и пептидов (т. е. направленных анализов), а не для широкого исследования содержимого образца (типичная цель протеомных открытий или обзорных экспериментов).
Метод
[ редактировать ]SISCAPA является расширением хорошо известных методов разведения стабильных изотопов, являющихся золотым стандартом , для количественного определения малых молекул с помощью масс-спектрометрии (МС). [ 3 ] Вместо непосредственного измерения интактного белка с помощью масс-спектрометрии SISCAPA использует протеолитическое расщепление (например, с помощью фермента трипсина) для расщепления белков образца на более мелкие пептиды, идеально подходящие для количественного анализа с помощью масс-спектрометрии. Выбирая целевой пептид, последовательность которого встречается только в выбранном целевом белке (так называемый «протеотипический» пептид), целевой пептид может служить прямым количественным заменителем целевого белка (при условии, что процесс переваривания завершен или, по крайней мере, воспроизводимо). Синтетическая версия целевого пептида, содержащая метку стабильного изотопа, добавляется в известном количестве к расщепленному образцу и служит внутренним стандартом (SIS). Поскольку целевой пептид и SIS химически неразличимы на протяжении всего рабочего процесса, но могут быть измерены отдельно с помощью масс-спектрометра из-за разницы масс метки стабильного изотопа, их соотношение обеспечивает желаемую количественную оценку количества целевого пептида.
Рабочий процесс SISCAPA добавляет к методу изотопного разведения специальный этап обогащения, в котором выбранный целевой пептид вместе со связанным с ним внутренним стандартом SIS захватывается специфичным для последовательности антипептидным антителом . Затем антитело вместе с захваченным целевым пептидом отделяют от сложного расщепленного образца, после чего высокоочищенный пептид элюируется из антитела и доставляется в масс-спектрометр для измерения. Этап захвата был реализован с использованием антител, связанных с магнитными шариками. [ 4 ] [ 5 ] а также антитела, иммобилизованные на проточных колонках. [ 6 ] Добавление этого конкретного этапа захвата обеспечивает два основных преимущества по сравнению с традиционным рабочим процессом анализа гидролизата нефракционированной пробы: чувствительность и производительность.
Антитело можно использовать для захвата целевого пептида (и SIS) из гораздо большей массы образца, чем можно было бы проанализировать непосредственно с помощью МС, что позволяет измерять более низкие концентрации. На практике с помощью этого подхода чувствительность анализа можно повысить в 1000–10 000 раз.
За счет удаления несвязанных (нецелевых) пептидов, присутствующих в гидролизате образца, образец, подаваемый в масс-спектрометр, значительно упрощается, тем самым уменьшая необходимость разделения пептидов с помощью жидкостной хроматографии перед МС-анализом. В некоторых случаях жидкостная хроматография была полностью исключена, в результате чего время цикла МС составляло 7–20 секунд. [ 7 ] [ 8 ] вместо 5–40 минут, необходимых для типичных протоколов нефракционированного гидролиза, включающих обширное хроматографическое разделение.
Благодаря исключительной специфичности масс-спектрометрического обнаружения анализы SISCAPA можно объединять в мультиплексные панели без перекрестного взаимодействия анализов. Панели, объединяющие 22, [ 9 ] 50, [ 10 ] и 150 [ 11 ] Было продемонстрировано проведение анализов в рамках одной операции.
Использование SISCAPA протеолитического расщепления в качестве первого шага устраняет комплексы белок:белок (включая комплексы целевого белка с аутоантителами), которые вызывают «помехи» в анализах захвата белка, включая традиционные иммуноанализы (например, анализы ELISA). Устранение такого вмешательства аутоантител привело к принятию [ 12 ] [ 13 ] SISCAPA как альтернатива иммуноанализам для клинического измерения тиреоглобулина как маркера рецидива рака щитовидной железы у пациентов, у которых обнаруживаются аутоантитела к тиреоглобулину.
Ограничением подхода к специфическому захвату пептида является потребность в специально разработанном антителе против выбранного пептида. На сегодняшний день разработано несколько сотен реагентов против пептидных антител для обогащения триптических пептидов из гидролизатов образцов, в основном для установленных клинических биомаркеров (, [ 14 ] ) и цели исследования рака, [ 15 ] но они еще не охватывают большинство белков-мишеней, представляющих интерес для нераковых исследований или клинических контекстов. [ 16 ]
Для количественного определения обогащенных пептидов использовались различные типы приборов МС, в том числе чаще всего тройные квадрупольные масс-спектрометры, реализующие метод « мониторинга множественных реакций » (MRM) (формат, иногда называемый «иммуно-MRM»). [ 17 ] ) и MALDI-ToF (формат, иногда называемый iMALDI [ 18 ] ).
Связанные методы
[ редактировать ]Альтернативные конкретные методы обогащения включают MSIA. [ 19 ] (« масс-спектрометрический иммуноанализ »,), при котором антитела используются для обогащения целевых белков, которые анализируются с помощью МС в неизмененном виде; и гибридные методы [ 20 ] в котором антитела используются для обогащения целевых белков, которые затем расщепляются перед обнаружением пептидов с помощью МС.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Андерсон, Н. Ли; Андерсон, Норман Г.; Хейнс, Ли Р.; Харди, Дэррил Б.; Олафсон, Роберт В.; Пирсон, Терри В. (2004). «Масс-спектрометрическое количественное определение пептидов и белков с использованием стандартов стабильных изотопов и захвата антипептидными антителами (SISCAPA)». Журнал исследований протеома . 3 (2): 235–244. дои : 10.1021/pr034086h . ISSN 1535-3893 . ПМИД 15113099 .
- ^ Тимоти Д. Винстра (30 мая 2013 г.). Протеомные применения в обнаружении и обнаружении рака . Джон Уайли и сыновья. стр. 263–. ISBN 978-1-118-63441-7 .
- ^ Брун, Вирджиния; Масселон, Кристоф; Гарен, Жером; Дюпюи, Ален (2009). «Стратегии разведения изотопов для абсолютной количественной протеомики». Журнал протеомики . 72 (5): 740–749. дои : 10.1016/j.jprot.2009.03.007 . ISSN 1874-3919 . ПМИД 19341828 .
- ^ Уайтакер Дж., Чжао Л., Чжан Х., Фэн Л., Пининг Б., Андерсон Л. и др. Обогащение пептидов на основе антител на магнитных шариках для количественного определения сывороточных биомаркеров на основе масс-спектрометрии. Анальная Биохимия [Интернет]. 1 марта 2007 г.; 362 (1): 44–54.
- ^ Разави М., Ли Андерсон Н., Поуп М.Э., Йип Р., Пирсон Т.В. Высокоточная количественная оценка белков плазмы человека с использованием автоматизированного рабочего процесса SISCAPA Immuno-MS. Новая биотехнология. 2016 6 января.
- ^ Оканья М.Ф., Нойберт Х. Анализ иммуноаффинной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии для количественного определения матриксной металлопротеиназы 9 в сыворотке мышей. Анальная биохимия. 15 апреля 2010 г.; 399(2): 202–10.
- ^ Разави М., Фрик Л.Е., Ламарр В.А., Поуп М.Э., Миллер Калифорния, Андерсон Н.Л. и др. Высокопроизводительный SISCAPA количественный анализ пептидов из гидролизатов плазмы человека с помощью сверхбыстрой масс-спектрометрии без жидкостной хроматографии. J Протеом Рез. 2012, 19 ноября;: 121119143208008–8.
- ^ Разави М., Джонсон С.Д., Лам Дж.Дж., Круппа Г., Андерсон Н.Л., Пирсон Т.В. Количественное определение протеотипического пептида из ингибитора протеина C с помощью масс-спектрометрии SISCAPA-MALDI без жидкостной хроматографии: применение для выявления рецидива рака простаты. Клин Чем. Октябрь 2013 г.;59(10):1514–22.
- ^ Разави М., Андерсон Н.Л., Йип Р., Поуп М.Э., Пирсон Т.В. Мультиплексное продольное измерение белковых биомаркеров в DBS с использованием автоматизированного рабочего процесса SISCAPA. Биоанализ. 2016 15 июля.
- ^ Уайтакер-младший, Чжао Л., Линь С., Ян П., Ван П., Павлович А.Г. Последовательное мультиплексное количественное определение аналитов с использованием иммуноаффинного обогащения пептидов в сочетании с масс-спектрометрией. 12 июня 2012 г.; 11(6): M111.015347–7.
- ^ Ипполити П.Дж., Кун Э., Мани Д.Р., Фагбами Л., Кешишян Х., Берджесс М.В. и др. Автоматизированная микрохроматография позволяет мультиплексировать иммуноаффинное обогащение пептидов до более чем 150 для целевых анализов на основе МС. Анальная хим. 2 августа 2016 г.; 88 (15): 7548–55.
- ^ Хофнагл АН. Сывороточный тиреоглобулин: модель несовершенства иммуноанализа. 2006;(8):12–4.
- ^ Хофнагл А.Н., Рот М.И. Улучшение измерения сывороточного тиреоглобулина с помощью масс-спектрометрии. J Clin Эндокринол Метаб. Апрель 2013 г.; 98 (4): 1343–52.
- ^ Андерсон Н.Л. Клинический протеом плазмы: обзор клинических анализов белков в плазме и сыворотке. Клин Чем. 28 января 2010 г.; 56 (2): 177–85.
- ^ Уайтакер-младший, Чжао Л., Ян П., Айви Р.Г., Войтович У.Дж., Мур Х.Д. и др. Иммуноаффинное обогащение пептидов и целевая масс-спектрометрия позволяют проводить мультиплексные количественные фармакодинамические исследования передачи фосфосигналов. 18 мая 2015 г.;:mcp.O115.050351.
- ^ Андерсон Н.Л., Андерсон Н.Г., Пирсон Т.В., Борчерс Ч., Павлович А.Г., Паттерсон С.Д. и др. Проект обнаружения и количественного определения протеома человека. Май 2009 г.;8(5):883–6.
- ^ Чжао Л., Уайтакер-младший, Войтович У.Дж., Айви Р.Г., Павлович А.Г. Магнитные шарики, связанные с антителами, можно повторно использовать в иммуно-MRM-анализах, чтобы снизить затраты и расширить запасы антител. J Протеом Рез. 2 октября 2015 г.; 14 (10): 4425–31.
- ^ Цзян Дж., Паркер CE, Фуллер JR, Кавула TH, Борчерс CH. Иммуноаффинный тандемный масс-спектрометрический анализ (iMALDI) для обнаружения Francesella tularensis. Аннал Чим Акта. 12 декабря 2007 г.; 605 (1): 70–9.
- ^ Нельсон Р., Кроне Дж., Бибер А. Масс-спектрометрический иммуноанализ. Анальная хим. 1995 год
- ^ Акерманн Б.Л. Гибридные иммуноаффинно-масс-спектрометрические методы для эффективной проверки белковых биомаркеров в фармацевтических разработках. Биоанализ. Future Science Ltd, Лондон, Великобритания; 2009 май;1(2):265–8.