Насосно-зондовая микроскопия
Насосно-зондовая микроскопия — это метод нелинейной оптической визуализации, используемый в фемтохимии для изучения химических реакций . Он генерирует высококонтрастные изображения от эндогенных нефлуоресцентных мишеней. Он имеет множество применений, включая материаловедение , медицину и реставрацию произведений искусства .
Преимущества
[ редактировать ]Классический метод нелинейного поглощения, используемый микроскопистами, — это обычная двухфотонная флуоресценция , при которой два фотона из одного источника взаимодействуют, возбуждая фотоэлектрон. Затем электрон испускает фотон и возвращается в основное состояние. Этот метод микроскопии стал революционным в биологических науках благодаря присущим ему возможностям получения трехмерных оптических срезов.
Двухфотонное поглощение по своей сути является нелинейным процессом : выходная интенсивность флуоресценции пропорциональна квадрату интенсивности возбуждающего света. Это гарантирует, что флуоресценция генерируется только внутри фокуса лазерного луча, поскольку интенсивность за пределами этой плоскости недостаточна для возбуждения фотоэлектрона. [ 1 ]
Однако этот метод микроскопии по своей сути ограничен количеством биологических молекул, которые могут подвергаться как двухфотонному возбуждению, так и флуоресценции . [ 2 ]
Насосно-зондовая микроскопия обходит это ограничение за счет непосредственного измерения возбуждающего света. Это расширяет число потенциальных мишеней до любой молекулы, способной к двухфотонному поглощению, даже если она не флуоресцирует при релаксации. [ 3 ] Метод модулирует амплитуду импульсного лазерного луча, называемого накачкой , чтобы привести целевую молекулу в возбужденное состояние . Затем это повлияет на свойства второго когерентного луча, называемого зондом , основанного на взаимодействии двух лучей с молекулой. Эти свойства затем измеряются детектором для формирования изображения.
Физика насосно-зондовой микроскопии
[ редактировать ]Поскольку в методе насосно-зондовой микроскопии не используются флуоресцентные мишени, этот метод использует преимущества нескольких различных типов многофотонного поглощения.
Двухфотонное поглощение
[ редактировать ]Двухфотонное поглощение (ДФА) — это процесс третьего порядка, при котором два фотона почти одновременно поглощаются одной и той же молекулой. Если второй фотон поглощается тем же электроном в рамках того же квантового события, электрон переходит в возбужденное состояние . [ 4 ]
Это то же явление, что и в двухфотонной микроскопии (TPM), но есть две ключевые особенности, которые отличают насосно-зондовую микроскопию от TPM. Во-первых, поскольку молекула не обязательно флуоресцентна, фотодетектор интенсивность зонда измеряет . Следовательно, сигнал уменьшается по мере того, как происходит двухфотонное поглощение, противоположное TPM. [ 3 ]
Во-вторых, в микроскопии накачки-зонда используются спектрально разделенные источники для каждого фотона, тогда как в традиционной ТРМ используется один источник с одной длиной волны. Это называется вырожденным двухфотонным возбуждением. [ 3 ]
Поглощение в возбужденном состоянии
[ редактировать ]Поглощение в возбужденном состоянии (ESA) происходит, когда луч накачки переводит электрон в возбужденное состояние, а затем зондирующий луч переводит электрон в более возбужденное состояние. Это отличается от ДТС прежде всего временными рамками, в течение которых оно происходит. Поскольку электрон может оставаться в возбужденном состоянии в течение наносекунд , поэтому требуется более длительная длительность импульса, чем TPA. [ 5 ]
Вынужденное излучение
[ редактировать ]Насосно-зондовая микроскопия также может измерять стимулированное излучение . В этом случае луч накачки переводит электрон в возбужденное состояние. Затем электрон испускает фотон при воздействии зондирующего луча. Это взаимодействие увеличивает зондирующий сигнал на месте детектора.
Истощение основного состояния
[ редактировать ]Истощение основного состояния происходит, когда луч накачки переводит электрон в возбужденное состояние. Однако, в отличие от ЭИЛ, зондирующий луч не может перевести электрон во вторичное возбужденное состояние. Вместо этого он отправляет оставшиеся электроны из основного состояния в первое возбужденное состояние. Однако, поскольку луч накачки уменьшил количество электронов в основном состоянии, меньшее количество пробных фотонов поглощается, и зондирующий сигнал увеличивается в месте детектора. [ 3 ]
Перекрестная фазовая модуляция
[ редактировать ]Перекрестная фазовая модуляция вызвана эффектом Керра , при котором показатель преломления образца изменяется в присутствии большого электрического поля. [ 6 ] В этом случае луч накачки модулирует фазу зонда, которую затем можно измерить с помощью интерферометрических методов . В некоторых случаях, называемых сдвигом спектра перекрестной фазовой модуляции , это изменение фазы вызывает изменение спектра накачки, которое можно обнаружить с помощью спектрального фильтра. [ 3 ]
Оптическая конструкция
[ редактировать ]Возбуждение
[ редактировать ]Измерение нелинейно-оптических взаимодействий требует высокого уровня мгновенной мощности и очень точного времени. Чтобы достичь большого количества фотонов, необходимых для генерации этих взаимодействий, избегая при этом повреждения деликатных образцов, этим микроскопам требуется лазер с синхронизацией моделей . Эти лазеры могут достигать очень большого количества фотонов в фемтосекундном масштабе времени и поддерживать низкую среднюю мощность. В большинстве систем используется усиливающая среда Ti:Sapph из-за широкого диапазона длин волн, к которому она может получить доступ. [ 3 ] [ 7 ]
Обычно для создания насоса и зонда используется один и тот же источник. Оптический параметрический генератор (ОПО) используется для преобразования зондирующего луча в нужную длину волны. Длина волны зонда может быть настроена в широком диапазоне для спектроскопических приложений. [ 7 ]
Однако для некоторых типов двухфотонных взаимодействий возможно использование отдельных импульсных источников. [ 3 ] Это возможно только при таких взаимодействиях, как поглощение в возбужденном состоянии, при котором электроны остаются в возбужденном состоянии в течение нескольких пикосекунд. Однако чаще используется один фемтосекундный источник с двумя отдельными путями луча разной длины для модуляции времени между лучами накачки и зондирования. [ 3 ] [ 7 ]
Амплитуда пучка накачки модулируется с помощью акустооптического или электрооптического модулятора порядка 10 7 Гц. Затем лучи накачки и зондирования повторно объединяются с помощью дихроичного светоделителя и сканируются с помощью гальванометрических зеркал для создания точечного изображения перед фокусировкой на образце. [ 3 ]
Обнаружение
[ редактировать ]Сигнал, генерируемый модуляцией зонда, намного меньше, чем исходный луч накачки, поэтому они спектрально разделены на пути обнаружения с помощью дихроичного зеркала . Зондирующий сигнал может быть собран с помощью многих различных типов фотодетекторов , обычно фотодиода . Затем модулированный сигнал усиливается с помощью синхронного усилителя, настроенного на частоту модуляции накачки. [ 3 ]
Анализ данных
[ редактировать ]Подобно анализу гиперспектральных данных, данные визуализации насос-зонд, известные как суммирование задержек, должны быть обработаны для получения изображения с молекулярным контрастом основных видов молекул. [ 3 ] Обработка данных насос-зонд является сложной задачей по нескольким причинам: например, сигналы являются биполярными (положительными и отрицательными), мультиэкспоненциальными и могут быть существенно изменены из-за небольших изменений в химической среде. [ 8 ] [ 9 ] Основными методами анализа данных насос-зонд являются многоэкспоненциальная аппроксимация, анализ главных компонент и векторный анализ . [ 3 ] [ 7 ]
Мультиэкспоненциальная аппроксимация
[ редактировать ]При многоэкспоненциальной аппроксимации кривые с временным разрешением снабжаются моделью экспоненциального затухания для определения констант затухания. Хотя этот метод прост, он имеет низкую точность. [ 7 ]
Анализ главных компонентов
[ редактировать ]Анализ главных компонентов (PCA) был одним из самых ранних методов, используемых для анализа данных насос-зонд, поскольку он обычно используется для анализа гиперспектральных данных. PCA разлагает данные на ортогональные компоненты. В исследованиях меланомы основные компоненты показали хорошее согласие с сигналами, полученными от различных форм меланина . [ 10 ] Преимущество PCA заключается в том, что шум можно уменьшить, сохраняя только основные компоненты, на которые приходится большая часть дисперсии данных. Однако основные компоненты не обязательно отражают фактические свойства основных химических веществ, которые обычно неортогональны. [ 3 ] Таким образом, ограничением является то, что количество уникальных химических видов невозможно определить с помощью PCA. [ 3 ]
Фазорный анализ
[ редактировать ]Фазорный анализ обычно используется для флуоресцентной визуализационной микроскопии (FLIM). анализа данных [ 11 ] и был адаптирован для анализа данных визуализации с помощью насоса и зонда. [ 8 ] Сигналы разлагаются на действительную и мнимую части преобразования Фурье на заданной частоте. распределение различных хромофоров с разным временем жизни. Сопоставляя действительную и мнимую части друг с другом, можно отобразить [ 3 ] [ 7 ] В исследованиях меланомы этот подход снова показал способность различать различные формы меланина. [ 8 ] Одним из основных преимуществ векторного анализа является то, что он обеспечивает интуитивное качественное графическое представление контента. [ 7 ] Его также комбинировали с PCA для количественного анализа. [ 12 ]
Приложения
[ редактировать ]Развитие высокоскоростных и высокочувствительных методов визуализации с помощью насоса и зонда позволило применить их в нескольких областях, таких как материаловедение, биология и искусство. [ 3 ] [ 7 ]
Материаловедение
[ редактировать ]Насосно-зондовая визуализация идеально подходит для изучения и определения характеристик наноматериалов, таких как графен, [ 13 ] нанокубы, [ 14 ] нанопровода, [ 15 ] и различные полупроводники, [ 16 ] [ 17 ] из-за их большой восприимчивости, но слабой флуоресценции. В частности, одностенные углеродные нанотрубки были тщательно изучены и получены изображения с субмикрометровым разрешением. [ 18 ] предоставление подробной информации о динамике носителей, фотофизических и фотохимических свойствах. [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]
Биология
[ редактировать ]Первым применением метода «насос-зонд» в биологии была визуализация in vitro стимулированного излучения меченых красителем клеток. [ 22 ] В настоящее время для визуализации меланина широко используется зондовая визуализация, позволяющая различать две основные формы меланина — эумеланин (коричневый/черный) и феомеланин (красный/желтый). [ 23 ] При меланоме уровень эумеланина существенно повышен. Таким образом, визуализация распределения эумеланина и феомеланина может помочь отличить доброкачественные образования от меланомы с высокой чувствительностью. [ 24 ]
Искусство
[ редактировать ]Произведения искусства состоят из множества пигментов с широким диапазоном спектральных свойств поглощения, определяющих их цвет. Из-за широких спектральных особенностей этих пигментов идентификация конкретного пигмента в смеси затруднена. Визуализация с помощью насоса и зонда может предоставить точную молекулярную информацию с высоким разрешением. [ 25 ] и различать пигменты, которые могут даже иметь одинаковый визуальный цвет. [ 26 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Денк, Винифрид; Стриклер, Джеймс Х.; Уэбб, Ватт В. (1990). «Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия». Наука . 248 (4951): 73–76. дои : 10.1126/science.2321027 . ПМИД 2321027 .
- ^ Зипфель, Уоррен Р.; Уильямс, Ребекка М.; Уэбб, Ватт В. (2003). «Нелинейная магия: многофотонная микроскопия в биологических науках». Природная биотехнология . 21 (11): 1369–1377. дои : 10.1038/nbt899 . ПМИД 14595365 . S2CID 18475227 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п Фишер, Мартин С.; Уилсон, Джесси В.; Роблес, Франциско Э.; Уоррен, Уоррен С. (2016). «Приглашенная обзорная статья: Насосно-зондовая микроскопия» . Обзор научных инструментов . 87 (3): 031101. Бибкод : 2016RScI...87c1101F . дои : 10.1063/1.4943211 . ПМЦ 4798998 . ПМИД 27036751 .
- ^ Диаспро, Альберто; Кирико, Джузеппе; Коллини, Маддалена (2005). «Двухфотонное возбуждение флуоресценции и связанные с ним методы в биологической микроскопии». Ежеквартальные обзоры биофизики . 38 (2): 97–166. дои : 10.1017/S0033583505004129 . ПМИД 16478566 . S2CID 33514441 .
- ^ Чжоу, Гуанъюн; Ван, Донг; Ван, Сяомэй; Шао, Цзуншу; Цзян, Минхуа (2004). «Двухфотонное поглощение и свойства поглощения возбужденного состояния органического красителя PSPI». Оптические коммуникации . 241 (1–3): 215–219. дои : 10.1016/j.optcom.2004.06.059 .
- ^ Салех, East EA, Малвин Карл Тейх (1991). Основы фотоники Том. 22. Нью-Йорк: Уайли.
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Пу-Тин Донг; Цзи-Синь Ченг (2017). «Насосно-зондовая микроскопия: теория, приборы и приложения» . Спектроскопия . 32 (4): 2–11.
- ^ Jump up to: а б с Роблес, Франциско Э.; Уилсон, Джесси В.; Фишер, Мартин С.; Уоррен, Уоррен С. (2012). «Векторный анализ для нелинейной насосно-зондовой микроскопии» . Оптика Экспресс . 20 (15): 17082–17092. дои : 10.1364/OE.20.017082 . ПМК 3601636 .
- ^ Симпсон, Мэри Джейн; Уилсон, Джесси В.; Роблес, Франциско Э.; Далл, Кристофер П.; Гласс, Кили; Саймон, Джон Д.; Уоррен, Уоррен С. (2014). «Динамика возбужденного состояния меланинов в ближнем инфракрасном диапазоне: влияние содержания железа, фотоповреждения, химического окисления и размера агрегатов» . Журнал физической химии А. 118 (6): 993–1003. дои : 10.1021/jp4107475 . ПМЦ 3983346 . ПМИД 24446774 .
- ^ Мэтьюз, Томас Э.; Пилетич Иван Р.; Селим, М. Анжелика; Симпсон, Мэри Джейн; Уоррен, Уоррен С. (2011). «Визуализация с помощью насоса-зонда позволяет отличить меланому от меланоцитарных невусов» . Наука трансляционной медицины . 3 (71): 71ра15. doi : 10.1126/scitranslmed.3001604 . ПМЦ 3371363 . ПМИД 21346168 .
- ^ Дигман, Мишель А.; Кайолфа, Валерия Р.; Замаи, Морено; Граттон, Энрико (2008). «Фазорный подход к анализу флуоресцентных изображений на протяжении всей жизни» . Биофизический журнал . 94 (2): Л14–Л16. дои : 10.1529/biophysj.107.120154 . ПМК 2157251 . ПМИД 17981902 .
- ^ Роблес, Франциско Э.; Деб, Сангамитра; Уилсон, Джесси В.; Гейни, Кристина С.; Селим, М. Анжелика; Моска, Пол Дж.; Тайлер, Дуглас С.; Фишер, Мартин С.; Уоррен, Уоррен С. (2015). «Насосно-зондовая визуализация первичных поражений пигментированной меланомы кожи дает представление о метастатическом потенциале» . Биомедицинская оптика Экспресс . 6 (9): 3631–3645. дои : 10.1364/BOE.6.003631 . ПМЦ 4574685 . ПМИД 26417529 .
- ^ Ли, Джунджи; Чжан, Вэйся; Чунг, Тин-Фунг; Слипченко Михаил Н.; Чен, Юн П.; Ченг, Цзи-Синь; Ян, Чен (2015). «Высокочувствительная визуализация переходного поглощения графена и оксида графена в живых клетках и циркулирующей крови» . Научные отчеты . 5 : 12394. дои : 10.1038/srep12394 . ПМЦ 5378876 . ПМИД 26202216 .
- ^ Сталева, Кристина; Хартленд, Грегори В. (2008). «Колебательная динамика нанокубов и нанопроволок серебра, изученная методом спектроскопии одночастичного переходного поглощения». Передовые функциональные материалы . 18 (23): 3809–3817. дои : 10.1002/adfm.200800605 .
- ^ Ло, Шун Шан; Ши, Хун Ян; Хуан, Либай ; Хартленд, Грегори В. (2013). «Изображение степени возбуждения плазмона в нанопроволоках Au с помощью зондовой микроскопии». Оптические письма . 38 (8): 1265–1267. дои : 10.1364/OL.38.001265 . ПМИД 23595453 .
- ^ Вонг, Кэти Ю.; Пенвелл, Сэмюэл Б.; Коттс, Бенджамин Л.; Норьега, Родриго; Ву, Хао; Гинзберг, Наоми С. (2013). «Выявление динамики экситонов в низкомолекулярной органической полупроводниковой пленке с помощью субдоменной микроскопии переходного поглощения». Журнал физической химии C. 117 (42): 22111–22122. дои : 10.1021/jp407645k .
- ^ Полли, Дарио; Гранчини, Джулия; Кларк, Дженни; Они празднуют, Мишель; Виргили, Терсилла; Черулло, Джулио; Ланцани, Гульельмо (2010). «Наномасштабное изображение динамики интерфейса в полимерных смесях с помощью фемтосекундной конфокальной микроскопии с насосом и зондом». Продвинутые материалы . 22 (28): 3048–3051. дои : 10.1002/adma.200904387 . ПМИД 20578123 .
- ^ Тонг, Линг; Лю, Юйсян; Долаш, Бриджит Д.; Юнг, Юкён; Слипченко Михаил Н.; Бергстром, Дональд Э.; Ченг, Цзи-Синь (2012). «Безметочное изображение полупроводниковых и металлических углеродных нанотрубок в клетках и мышах с использованием микроскопии переходного поглощения». Природные нанотехнологии . 7 (1): 56–61. дои : 10.1038/nnano.2011.210 . ПМИД 22138864 .
- ^ Лоре, Дж.С.; Вуазен, К.; Кассабуа, Г.; Делаланд, К.; Руссиньоль, доктор философии; Йост, О.; Кейпс, Л. (2003). «Сверхбыстрая динамика носителей заряда в одностенных углеродных нанотрубках» (PDF) . Письма о физических отзывах . 90 (5): 057404. doi : 10.1103/PhysRevLett.90.057404 . ПМИД 12633397 .
- ^ Пак, Джэхон; Дерия, Правас; Териен, Майкл Дж. (2011). «Динамика и спектральные характеристики переходного поглощения одностенной углеродной нанотрубки, электронно возбужденного триплетного состояния». Журнал Американского химического общества . 133 (43): 17156–17159. дои : 10.1021/ja2079477 . ПМИД 21970339 .
- ^ Юнг, Юкён; Слипченко Михаил Н.; Лю, Чан Хуа; Риббе, Александр Э.; Чжун, Чжаохуэй; Ян, Чен; Ченг, Цзи-Синь (2010). «Быстрое обнаружение металлического состояния отдельных одностенных углеродных нанотрубок с использованием оптического микроскопа переходного поглощения». Письма о физических отзывах . 105 (21): 217401. doi : 10.1103/PhysRevLett.105.217401 . ПМИД 21231351 .
- ^ Донг, CY; Итак, ПТ; Френч, Т.; Граттон, Э. (1995). «Визуализация времени жизни флуоресценции с помощью асинхронной насосно-зондовой микроскопии» . Биофизический журнал . 69 (6): 2234–2242. дои : 10.1016/S0006-3495(95)80148-7 . ПМЦ 1236462 . ПМИД 8599631 .
- ^ Пилетич Иван Р.; Мэтьюз, Томас Э.; Уоррен, Уоррен С. (2010). «Изучение путей фоторелаксации в ближнем инфракрасном диапазоне в эумеланинах и феомеланинах» . Журнал физической химии А. 114 (43): 11483–11491. дои : 10.1021/jp103608d . ПМЦ 3334281 . ПМИД 20882951 .
- ^ Мэтьюз, Томас Э.; Уилсон, Джесси В.; Деган, Симона; Симпсон, Мэри Джейн; Джин, Джейн Ю.; Чжан, Дженнифер Ю.; Уоррен, Уоррен С. (2011). «Визуализация меланина и микроциркуляторного русла в эпи-режиме in vivo и ex vivo» . Биомедицинская оптика Экспресс . 2 (6): 1576–1583. дои : 10.1364/BOE.2.001576 . ПМК 3114225 . ПМИД 21698020 .
- ^ Виллафана, Тана Элизабет; Браун, Уильям П.; Делани, Джон К.; Палмер, Майкл; Уоррен, Уоррен С.; Фишер, Мартин К. (2014). «Фемтосекундная зондовая микроскопия создает виртуальные поперечные сечения исторических произведений искусства» . Труды Национальной академии наук . 111 (5): 1708–1713. дои : 10.1073/pnas.1317230111 . ПМЦ 3918778 . ПМИД 24449855 .
- ^ Саминени, Пратьюш; Декруз, Адель; Вильяфанья, Тана Э.; Уоррен, Уоррен С.; Фишер, Мартин К. (2012). «Насос-зондовое изображение исторических пигментов, используемых в картинах». Оптические письма . 37 (8): 1310–1312. дои : 10.1364/OL.37.001310 . ПМИД 22513669 .