Jump to content

Насосно-зондовая микроскопия

Насосно-зондовая микроскопия — это метод нелинейной оптической визуализации, используемый в фемтохимии для изучения химических реакций . Он генерирует высококонтрастные изображения от эндогенных нефлуоресцентных мишеней. Он имеет множество применений, включая материаловедение , медицину и реставрацию произведений искусства .

Преимущества

[ редактировать ]

Классический метод нелинейного поглощения, используемый микроскопистами, — это обычная двухфотонная флуоресценция , при которой два фотона из одного источника взаимодействуют, возбуждая фотоэлектрон. Затем электрон испускает фотон и возвращается в основное состояние. Этот метод микроскопии стал революционным в биологических науках благодаря присущим ему возможностям получения трехмерных оптических срезов.

Двухфотонное поглощение по своей сути является нелинейным процессом : выходная интенсивность флуоресценции пропорциональна квадрату интенсивности возбуждающего света. Это гарантирует, что флуоресценция генерируется только внутри фокуса лазерного луча, поскольку интенсивность за пределами этой плоскости недостаточна для возбуждения фотоэлектрона. [ 1 ]

Однако этот метод микроскопии по своей сути ограничен количеством биологических молекул, которые могут подвергаться как двухфотонному возбуждению, так и флуоресценции . [ 2 ]

Насосно-зондовая микроскопия обходит это ограничение за счет непосредственного измерения возбуждающего света. Это расширяет число потенциальных мишеней до любой молекулы, способной к двухфотонному поглощению, даже если она не флуоресцирует при релаксации. [ 3 ] Метод модулирует амплитуду импульсного лазерного луча, называемого накачкой , чтобы привести целевую молекулу в возбужденное состояние . Затем это повлияет на свойства второго когерентного луча, называемого зондом , основанного на взаимодействии двух лучей с молекулой. Эти свойства затем измеряются детектором для формирования изображения.

Физика насосно-зондовой микроскопии

[ редактировать ]

Поскольку в методе насосно-зондовой микроскопии не используются флуоресцентные мишени, этот метод использует преимущества нескольких различных типов многофотонного поглощения.

Двухфотонное поглощение

[ редактировать ]

Двухфотонное поглощение (ДФА) — это процесс третьего порядка, при котором два фотона почти одновременно поглощаются одной и той же молекулой. Если второй фотон поглощается тем же электроном в рамках того же квантового события, электрон переходит в возбужденное состояние . [ 4 ]

Это то же явление, что и в двухфотонной микроскопии (TPM), но есть две ключевые особенности, которые отличают насосно-зондовую микроскопию от TPM. Во-первых, поскольку молекула не обязательно флуоресцентна, фотодетектор интенсивность зонда измеряет . Следовательно, сигнал уменьшается по мере того, как происходит двухфотонное поглощение, противоположное TPM. [ 3 ]

Во-вторых, в микроскопии накачки-зонда используются спектрально разделенные источники для каждого фотона, тогда как в традиционной ТРМ используется один источник с одной длиной волны. Это называется вырожденным двухфотонным возбуждением. [ 3 ]

Поглощение в возбужденном состоянии

[ редактировать ]

Поглощение в возбужденном состоянии (ESA) происходит, когда луч накачки переводит электрон в возбужденное состояние, а затем зондирующий луч переводит электрон в более возбужденное состояние. Это отличается от ДТС прежде всего временными рамками, в течение которых оно происходит. Поскольку электрон может оставаться в возбужденном состоянии в течение наносекунд , поэтому требуется более длительная длительность импульса, чем TPA. [ 5 ]

Вынужденное излучение

[ редактировать ]

Насосно-зондовая микроскопия также может измерять стимулированное излучение . В этом случае луч накачки переводит электрон в возбужденное состояние. Затем электрон испускает фотон при воздействии зондирующего луча. Это взаимодействие увеличивает зондирующий сигнал на месте детектора.

Истощение основного состояния

[ редактировать ]

Истощение основного состояния происходит, когда луч накачки переводит электрон в возбужденное состояние. Однако, в отличие от ЭИЛ, зондирующий луч не может перевести электрон во вторичное возбужденное состояние. Вместо этого он отправляет оставшиеся электроны из основного состояния в первое возбужденное состояние. Однако, поскольку луч накачки уменьшил количество электронов в основном состоянии, меньшее количество пробных фотонов поглощается, и зондирующий сигнал увеличивается в месте детектора. [ 3 ]

Перекрестная фазовая модуляция

[ редактировать ]

Перекрестная фазовая модуляция вызвана эффектом Керра , при котором показатель преломления образца изменяется в присутствии большого электрического поля. [ 6 ] В этом случае луч накачки модулирует фазу зонда, которую затем можно измерить с помощью интерферометрических методов . В некоторых случаях, называемых сдвигом спектра перекрестной фазовой модуляции , это изменение фазы вызывает изменение спектра накачки, которое можно обнаружить с помощью спектрального фильтра. [ 3 ]

Оптическая конструкция

[ редактировать ]

Возбуждение

[ редактировать ]

Измерение нелинейно-оптических взаимодействий требует высокого уровня мгновенной мощности и очень точного времени. Чтобы достичь большого количества фотонов, необходимых для генерации этих взаимодействий, избегая при этом повреждения деликатных образцов, этим микроскопам требуется лазер с синхронизацией моделей . Эти лазеры могут достигать очень большого количества фотонов в фемтосекундном масштабе времени и поддерживать низкую среднюю мощность. В большинстве систем используется усиливающая среда Ti:Sapph из-за широкого диапазона длин волн, к которому она может получить доступ. [ 3 ] [ 7 ]

Обычно для создания насоса и зонда используется один и тот же источник. Оптический параметрический генератор (ОПО) используется для преобразования зондирующего луча в нужную длину волны. Длина волны зонда может быть настроена в широком диапазоне для спектроскопических приложений. [ 7 ]

Однако для некоторых типов двухфотонных взаимодействий возможно использование отдельных импульсных источников. [ 3 ] Это возможно только при таких взаимодействиях, как поглощение в возбужденном состоянии, при котором электроны остаются в возбужденном состоянии в течение нескольких пикосекунд. Однако чаще используется один фемтосекундный источник с двумя отдельными путями луча разной длины для модуляции времени между лучами накачки и зондирования. [ 3 ] [ 7 ]

Амплитуда пучка накачки модулируется с помощью акустооптического или электрооптического модулятора порядка 10 7 Гц. Затем лучи накачки и зондирования повторно объединяются с помощью дихроичного светоделителя и сканируются с помощью гальванометрических зеркал для создания точечного изображения перед фокусировкой на образце. [ 3 ]

Обнаружение

[ редактировать ]

Сигнал, генерируемый модуляцией зонда, намного меньше, чем исходный луч накачки, поэтому они спектрально разделены на пути обнаружения с помощью дихроичного зеркала . Зондирующий сигнал может быть собран с помощью многих различных типов фотодетекторов , обычно фотодиода . Затем модулированный сигнал усиливается с помощью синхронного усилителя, настроенного на частоту модуляции накачки. [ 3 ]

Анализ данных

[ редактировать ]

Подобно анализу гиперспектральных данных, данные визуализации насос-зонд, известные как суммирование задержек, должны быть обработаны для получения изображения с молекулярным контрастом основных видов молекул. [ 3 ] Обработка данных насос-зонд является сложной задачей по нескольким причинам: например, сигналы являются биполярными (положительными и отрицательными), мультиэкспоненциальными и могут быть существенно изменены из-за небольших изменений в химической среде. [ 8 ] [ 9 ] Основными методами анализа данных насос-зонд являются многоэкспоненциальная аппроксимация, анализ главных компонент и векторный анализ . [ 3 ] [ 7 ]

Мультиэкспоненциальная аппроксимация

[ редактировать ]

При многоэкспоненциальной аппроксимации кривые с временным разрешением снабжаются моделью экспоненциального затухания для определения констант затухания. Хотя этот метод прост, он имеет низкую точность. [ 7 ]

Анализ главных компонентов

[ редактировать ]

Анализ главных компонентов (PCA) был одним из самых ранних методов, используемых для анализа данных насос-зонд, поскольку он обычно используется для анализа гиперспектральных данных. PCA разлагает данные на ортогональные компоненты. В исследованиях меланомы основные компоненты показали хорошее согласие с сигналами, полученными от различных форм меланина . [ 10 ] Преимущество PCA заключается в том, что шум можно уменьшить, сохраняя только основные компоненты, на которые приходится большая часть дисперсии данных. Однако основные компоненты не обязательно отражают фактические свойства основных химических веществ, которые обычно неортогональны. [ 3 ] Таким образом, ограничением является то, что количество уникальных химических видов невозможно определить с помощью PCA. [ 3 ]

Фазорный анализ

[ редактировать ]

Фазорный анализ обычно используется для флуоресцентной визуализационной микроскопии (FLIM). анализа данных [ 11 ] и был адаптирован для анализа данных визуализации с помощью насоса и зонда. [ 8 ] Сигналы разлагаются на действительную и мнимую части преобразования Фурье на заданной частоте. распределение различных хромофоров с разным временем жизни. Сопоставляя действительную и мнимую части друг с другом, можно отобразить [ 3 ] [ 7 ] В исследованиях меланомы этот подход снова показал способность различать различные формы меланина. [ 8 ] Одним из основных преимуществ векторного анализа является то, что он обеспечивает интуитивное качественное графическое представление контента. [ 7 ] Его также комбинировали с PCA для количественного анализа. [ 12 ]

Приложения

[ редактировать ]

Развитие высокоскоростных и высокочувствительных методов визуализации с помощью насоса и зонда позволило применить их в нескольких областях, таких как материаловедение, биология и искусство. [ 3 ] [ 7 ]

Материаловедение

[ редактировать ]

Насосно-зондовая визуализация идеально подходит для изучения и определения характеристик наноматериалов, таких как графен, [ 13 ] нанокубы, [ 14 ] нанопровода, [ 15 ] и различные полупроводники, [ 16 ] [ 17 ] из-за их большой восприимчивости, но слабой флуоресценции. В частности, одностенные углеродные нанотрубки были тщательно изучены и получены изображения с субмикрометровым разрешением. [ 18 ] предоставление подробной информации о динамике носителей, фотофизических и фотохимических свойствах. [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]

Биология

[ редактировать ]

Первым применением метода «насос-зонд» в биологии была визуализация in vitro стимулированного излучения меченых красителем клеток. [ 22 ] В настоящее время для визуализации меланина широко используется зондовая визуализация, позволяющая различать две основные формы меланина — эумеланин (коричневый/черный) и феомеланин (красный/желтый). [ 23 ] При меланоме уровень эумеланина существенно повышен. Таким образом, визуализация распределения эумеланина и феомеланина может помочь отличить доброкачественные образования от меланомы с высокой чувствительностью. [ 24 ]

Искусство

[ редактировать ]

Произведения искусства состоят из множества пигментов с широким диапазоном спектральных свойств поглощения, определяющих их цвет. Из-за широких спектральных особенностей этих пигментов идентификация конкретного пигмента в смеси затруднена. Визуализация с помощью насоса и зонда может предоставить точную молекулярную информацию с высоким разрешением. [ 25 ] и различать пигменты, которые могут даже иметь одинаковый визуальный цвет. [ 26 ]

  1. ^ Денк, Винифрид; Стриклер, Джеймс Х.; Уэбб, Ватт В. (1990). «Двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия». Наука . 248 (4951): 73–76. дои : 10.1126/science.2321027 . ПМИД   2321027 .
  2. ^ Зипфель, Уоррен Р.; Уильямс, Ребекка М.; Уэбб, Ватт В. (2003). «Нелинейная магия: многофотонная микроскопия в биологических науках». Природная биотехнология . 21 (11): 1369–1377. дои : 10.1038/nbt899 . ПМИД   14595365 . S2CID   18475227 .
  3. ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п Фишер, Мартин С.; Уилсон, Джесси В.; Роблес, Франциско Э.; Уоррен, Уоррен С. (2016). «Приглашенная обзорная статья: Насосно-зондовая микроскопия» . Обзор научных инструментов . 87 (3): 031101. Бибкод : 2016RScI...87c1101F . дои : 10.1063/1.4943211 . ПМЦ   4798998 . ПМИД   27036751 .
  4. ^ Диаспро, Альберто; Кирико, Джузеппе; Коллини, Маддалена (2005). «Двухфотонное возбуждение флуоресценции и связанные с ним методы в биологической микроскопии». Ежеквартальные обзоры биофизики . 38 (2): 97–166. дои : 10.1017/S0033583505004129 . ПМИД   16478566 . S2CID   33514441 .
  5. ^ Чжоу, Гуанъюн; Ван, Донг; Ван, Сяомэй; Шао, Цзуншу; Цзян, Минхуа (2004). «Двухфотонное поглощение и свойства поглощения возбужденного состояния органического красителя PSPI». Оптические коммуникации . 241 (1–3): 215–219. дои : 10.1016/j.optcom.2004.06.059 .
  6. ^ Салех, East EA, Малвин Карл Тейх (1991). Основы фотоники Том. 22. Нью-Йорк: Уайли.
  7. ^ Jump up to: а б с д и ж г час Пу-Тин Донг; Цзи-Синь Ченг (2017). «Насосно-зондовая микроскопия: теория, приборы и приложения» . Спектроскопия . 32 (4): 2–11.
  8. ^ Jump up to: а б с Роблес, Франциско Э.; Уилсон, Джесси В.; Фишер, Мартин С.; Уоррен, Уоррен С. (2012). «Векторный анализ для нелинейной насосно-зондовой микроскопии» . Оптика Экспресс . 20 (15): 17082–17092. дои : 10.1364/OE.20.017082 . ПМК   3601636 .
  9. ^ Симпсон, Мэри Джейн; Уилсон, Джесси В.; Роблес, Франциско Э.; Далл, Кристофер П.; Гласс, Кили; Саймон, Джон Д.; Уоррен, Уоррен С. (2014). «Динамика возбужденного состояния меланинов в ближнем инфракрасном диапазоне: влияние содержания железа, фотоповреждения, химического окисления и размера агрегатов» . Журнал физической химии А. 118 (6): 993–1003. дои : 10.1021/jp4107475 . ПМЦ   3983346 . ПМИД   24446774 .
  10. ^ Мэтьюз, Томас Э.; Пилетич Иван Р.; Селим, М. Анжелика; Симпсон, Мэри Джейн; Уоррен, Уоррен С. (2011). «Визуализация с помощью насоса-зонда позволяет отличить меланому от меланоцитарных невусов» . Наука трансляционной медицины . 3 (71): 71ра15. doi : 10.1126/scitranslmed.3001604 . ПМЦ   3371363 . ПМИД   21346168 .
  11. ^ Дигман, Мишель А.; Кайолфа, Валерия Р.; Замаи, Морено; Граттон, Энрико (2008). «Фазорный подход к анализу флуоресцентных изображений на протяжении всей жизни» . Биофизический журнал . 94 (2): Л14–Л16. дои : 10.1529/biophysj.107.120154 . ПМК   2157251 . ПМИД   17981902 .
  12. ^ Роблес, Франциско Э.; Деб, Сангамитра; Уилсон, Джесси В.; Гейни, Кристина С.; Селим, М. Анжелика; Моска, Пол Дж.; Тайлер, Дуглас С.; Фишер, Мартин С.; Уоррен, Уоррен С. (2015). «Насосно-зондовая визуализация первичных поражений пигментированной меланомы кожи дает представление о метастатическом потенциале» . Биомедицинская оптика Экспресс . 6 (9): 3631–3645. дои : 10.1364/BOE.6.003631 . ПМЦ   4574685 . ПМИД   26417529 .
  13. ^ Ли, Джунджи; Чжан, Вэйся; Чунг, Тин-Фунг; Слипченко Михаил Н.; Чен, Юн П.; Ченг, Цзи-Синь; Ян, Чен (2015). «Высокочувствительная визуализация переходного поглощения графена и оксида графена в живых клетках и циркулирующей крови» . Научные отчеты . 5 : 12394. дои : 10.1038/srep12394 . ПМЦ   5378876 . ПМИД   26202216 .
  14. ^ Сталева, Кристина; Хартленд, Грегори В. (2008). «Колебательная динамика нанокубов и нанопроволок серебра, изученная методом спектроскопии одночастичного переходного поглощения». Передовые функциональные материалы . 18 (23): 3809–3817. дои : 10.1002/adfm.200800605 .
  15. ^ Ло, Шун Шан; Ши, Хун Ян; Хуан, Либай ; Хартленд, Грегори В. (2013). «Изображение степени возбуждения плазмона в нанопроволоках Au с помощью зондовой микроскопии». Оптические письма . 38 (8): 1265–1267. дои : 10.1364/OL.38.001265 . ПМИД   23595453 .
  16. ^ Вонг, Кэти Ю.; Пенвелл, Сэмюэл Б.; Коттс, Бенджамин Л.; Норьега, Родриго; Ву, Хао; Гинзберг, Наоми С. (2013). «Выявление динамики экситонов в низкомолекулярной органической полупроводниковой пленке с помощью субдоменной микроскопии переходного поглощения». Журнал физической химии C. 117 (42): 22111–22122. дои : 10.1021/jp407645k .
  17. ^ Полли, Дарио; Гранчини, Джулия; Кларк, Дженни; Они празднуют, Мишель; Виргили, Терсилла; Черулло, Джулио; Ланцани, Гульельмо (2010). «Наномасштабное изображение динамики интерфейса в полимерных смесях с помощью фемтосекундной конфокальной микроскопии с насосом и зондом». Продвинутые материалы . 22 (28): 3048–3051. дои : 10.1002/adma.200904387 . ПМИД   20578123 .
  18. ^ Тонг, Линг; Лю, Юйсян; Долаш, Бриджит Д.; Юнг, Юкён; Слипченко Михаил Н.; Бергстром, Дональд Э.; Ченг, Цзи-Синь (2012). «Безметочное изображение полупроводниковых и металлических углеродных нанотрубок в клетках и мышах с использованием микроскопии переходного поглощения». Природные нанотехнологии . 7 (1): 56–61. дои : 10.1038/nnano.2011.210 . ПМИД   22138864 .
  19. ^ Лоре, Дж.С.; Вуазен, К.; Кассабуа, Г.; Делаланд, К.; Руссиньоль, доктор философии; Йост, О.; Кейпс, Л. (2003). «Сверхбыстрая динамика носителей заряда в одностенных углеродных нанотрубках» (PDF) . Письма о физических отзывах . 90 (5): 057404. doi : 10.1103/PhysRevLett.90.057404 . ПМИД   12633397 .
  20. ^ Пак, Джэхон; Дерия, Правас; Териен, Майкл Дж. (2011). «Динамика и спектральные характеристики переходного поглощения одностенной углеродной нанотрубки, электронно возбужденного триплетного состояния». Журнал Американского химического общества . 133 (43): 17156–17159. дои : 10.1021/ja2079477 . ПМИД   21970339 .
  21. ^ Юнг, Юкён; Слипченко Михаил Н.; Лю, Чан Хуа; Риббе, Александр Э.; Чжун, Чжаохуэй; Ян, Чен; Ченг, Цзи-Синь (2010). «Быстрое обнаружение металлического состояния отдельных одностенных углеродных нанотрубок с использованием оптического микроскопа переходного поглощения». Письма о физических отзывах . 105 (21): 217401. doi : 10.1103/PhysRevLett.105.217401 . ПМИД   21231351 .
  22. ^ Донг, CY; Итак, ПТ; Френч, Т.; Граттон, Э. (1995). «Визуализация времени жизни флуоресценции с помощью асинхронной насосно-зондовой микроскопии» . Биофизический журнал . 69 (6): 2234–2242. дои : 10.1016/S0006-3495(95)80148-7 . ПМЦ   1236462 . ПМИД   8599631 .
  23. ^ Пилетич Иван Р.; Мэтьюз, Томас Э.; Уоррен, Уоррен С. (2010). «Изучение путей фоторелаксации в ближнем инфракрасном диапазоне в эумеланинах и феомеланинах» . Журнал физической химии А. 114 (43): 11483–11491. дои : 10.1021/jp103608d . ПМЦ   3334281 . ПМИД   20882951 .
  24. ^ Мэтьюз, Томас Э.; Уилсон, Джесси В.; Деган, Симона; Симпсон, Мэри Джейн; Джин, Джейн Ю.; Чжан, Дженнифер Ю.; Уоррен, Уоррен С. (2011). «Визуализация меланина и микроциркуляторного русла в эпи-режиме in vivo и ex vivo» . Биомедицинская оптика Экспресс . 2 (6): 1576–1583. дои : 10.1364/BOE.2.001576 . ПМК   3114225 . ПМИД   21698020 .
  25. ^ Виллафана, Тана Элизабет; Браун, Уильям П.; Делани, Джон К.; Палмер, Майкл; Уоррен, Уоррен С.; Фишер, Мартин К. (2014). «Фемтосекундная зондовая микроскопия создает виртуальные поперечные сечения исторических произведений искусства» . Труды Национальной академии наук . 111 (5): 1708–1713. дои : 10.1073/pnas.1317230111 . ПМЦ   3918778 . ПМИД   24449855 .
  26. ^ Саминени, Пратьюш; Декруз, Адель; Вильяфанья, Тана Э.; Уоррен, Уоррен С.; Фишер, Мартин К. (2012). «Насос-зондовое изображение исторических пигментов, используемых в картинах». Оптические письма . 37 (8): 1310–1312. дои : 10.1364/OL.37.001310 . ПМИД   22513669 .
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 89630311677b34159875cf4e854b6150__1712412240
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/89/50/89630311677b34159875cf4e854b6150.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Pump–probe microscopy - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)