Линейный дихроизм
Линейный дихроизм ( LD ) или дизатухание — это разница между поглощением света, поляризованного параллельно и поляризованного перпендикулярно оси ориентации. [1] Это свойство материала, коэффициент пропускания которого зависит от ориентации падающего на него линейно поляризованного света. Как метод он в основном используется для изучения функциональности и структуры молекул . Измерения ЛД основаны на взаимодействии вещества и света и, таким образом, являются формой электромагнитной спектроскопии .
Этот эффект был применен в ЭМ-спектре , где свет разных длин волн может исследовать множество химических систем. В настоящее время ЛД преимущественно используется при изучении биомакромолекул ( например, ДНК ), а также синтетических полимеров .
Основная информация
[ редактировать ]Линейная поляризация
[ редактировать ]В ЛД используется линейно поляризованный свет, то есть свет, поляризованный только в одном направлении. Это создает волну, вектор электрического поля , который колеблется только в одной плоскости, создавая классическую синусоидальную форму волны, когда свет проходит через пространство. Используя свет, параллельный и перпендикулярный направлению ориентации, можно измерить, насколько больше энергии поглощается в одном измерении молекулы по сравнению с другим, предоставляя информацию экспериментатору.
Поскольку свет взаимодействует с исследуемой молекулой, если молекула начнет поглощать свет, тогда электронная плотность внутри молекулы будет смещаться, поскольку электрон становится фотовозбужденным . Это движение заряда известно как электронный переход , направление которого называется поляризацией электрического перехода. Именно это свойство и является показателем LD.
ЛД ориентированной молекулы можно рассчитать по следующему уравнению:
- ЛД = А ║ - А ┴
Где A ║ — оптическая плотность, параллельная оси ориентации, а A ┴ — оптическая плотность, перпендикулярная оси ориентации.
Обратите внимание, что для генерации сигнала LD можно использовать свет любой длины волны.
Таким образом, генерируемый сигнал LD имеет два ограничения на сигнал, который может быть сгенерирован. Для химической системы, электрический переход которой параллелен оси ориентации, можно записать следующее уравнение:
- ЛД = А ║ - А ┴ = А ║ > 0
Для большинства химических систем это представляет собой электрический переход, поляризованный по длине молекулы (т.е. параллельно оси ориентации).
В качестве альтернативы можно обнаружить, что поляризация электрического перехода совершенно перпендикулярна ориентации молекулы, что приводит к следующему уравнению:
- ЛД = А ║ - А ┴ = - А ┴ < 0
Это уравнение представляет сигнал ЛД, регистрируемый, если электрический переход поляризован по ширине молекулы (т.е. перпендикулярно оси ориентации), которая в случае ЛД является меньшей из двух исследуемых осей.
Таким образом, LD можно использовать двумя способами. Если ориентация молекул в потоке [ нужны разъяснения ] известно, то экспериментатор может посмотреть направление поляризации в молекуле (что дает представление о химической структуре молекулы), или, если направление поляризации неизвестно, его можно использовать как средство определения того, как ориентированы молекулы. поток молекулы.
УФ линейный дихроизм
[ редактировать ]Ультрафиолетовый (УФ) ЛД обычно используется при анализе биологических молекул, особенно больших, гибких и длинных молекул, структуру которых трудно определить такими методами, как ЯМР и дифракция рентгеновских лучей .
ДНК
[ редактировать ]ДНК практически идеально подходит для УФ-детектирования. Молекула очень длинная и очень тонкая, что позволяет легко ориентироваться в потоке. Это приводит к сильному сигналу LD. Системы ДНК, изученные с помощью УФ ЛД, включают комплексы ДНК- фермент и ДНК- лиганд . комплексы [2] образование последнего легко наблюдать в кинетических экспериментах.
Фиброзный белок
[ редактировать ]Фиброзные белки , такие как белки, участвующие в болезни Альцгеймера, и прионные белки соответствуют требованиям УФ-ЛД, поскольку они представляют собой класс длинных и тонких молекул. Кроме того, цитоскелетные белки [3] также можно измерить с помощью LD.
Мембранные белки
[ редактировать ]Введение мембранных белков в липидную мембрану контролировалось с помощью LD, предоставляя экспериментатору информацию об ориентации белка относительно липидной мембраны в разные моменты времени.
Кроме того, с помощью УФ ЛД были проанализированы другие типы молекул, включая углеродные нанотрубки. [4] и связанные с ними лигандные комплексы.
Методы выравнивания
[ редактировать ]Поток Куэтта
[ редактировать ]Система ориентации потока Куэтта является наиболее широко используемым методом ориентации образца для УФ ЛД. Он имеет ряд характеристик, которые делают его очень подходящим в качестве метода выравнивания образца. Течение Куэтта в настоящее время является единственным признанным средством ориентации молекул в фазе раствора. Для этого метода также требуется лишь очень небольшое количество образца анализа (20–40 мкл) для получения спектра LD. Постоянная рециркуляция образца является еще одним полезным свойством системы, позволяющим проводить множество повторных измерений каждого образца, уменьшая влияние шума на окончательный записанный спектр.
Принцип его работы очень прост: образец помещается между вращающейся трубкой и неподвижным стержнем. Когда образец вращается внутри ячейки, луч света проходит через образец, параллельное поглощение рассчитывается на основе горизонтально поляризованного света, перпендикулярное поглощение - на основе вертикально поляризованного света. УФ ЛД с потоком Куэтта в настоящее время является единственным коммерчески доступным средством ориентации ЛД.
Растянутая пленка
[ редактировать ]Линейный дихроизм растянутой пленки — это метод ориентации, основанный на включении молекул образца в полиэтиленовую пленку. [5] Затем полиэтиленовую пленку растягивают, в результате чего хаотично ориентированные молекулы на пленке «следуют» за движением пленки. Растяжение пленки приводит к тому, что молекулы образца ориентируются в направлении растяжения.
Сопутствующие методы
[ редактировать ]Круговой дихроизм
[ редактировать ]LD очень похож на круговой дихроизм (CD), но имеет два важных отличия. (i) В спектроскопии CD используется свет с круговой поляризацией, тогда как в LD используется свет с линейной поляризацией. (ii) В экспериментах по КД молекулы в растворе обычно свободны, поэтому они ориентированы случайным образом. Наблюдаемый спектр тогда является функцией только хиральной или асимметричной природы молекул в растворе. В случае биомакромолекул CD особенно полезен для определения вторичной структуры. Напротив, в экспериментах LD молекулы должны иметь преимущественную ориентацию, иначе LD=0. При работе с биомакромолекулами часто используют ориентацию потока, другие методы включают растягивание пленок, магнитные поля и сжатые гели. Таким образом, ЛД дает такую информацию, как выравнивание на поверхности или связывание небольшой молекулы с ориентированной по потоку макромолекулой, наделяя ее функциональностью, отличной от других спектроскопических методов. Различия между LD и CD дополняют друг друга и могут быть мощным средством выяснения структуры биологических молекул при их совместном использовании. Комбинация методов раскрывает гораздо больше информации, чем один метод по отдельности. Например, CD сообщает нам, когда мембранный пептид или белок сворачивается, тогда как LD сообщает, когда он вставляется в мембрану. [6]
Флуоресценция обнаружила линейный дихроизм
[ редактировать ]Линейный дихроизм, детектируемый флуоресценцией (FDLD), является очень полезным методом для экспериментаторов, поскольку он сочетает в себе преимущества УФ-ЛД, а также предлагает конфокальное детектирование флуоресцентного излучения. [7] FDLD находит применение в микроскопии, где его можно использовать в качестве средства двумерного картирования поверхности с помощью дифференциальной поляризационной спектроскопии (DPS), где анизотропия сканируемого объекта позволяет записывать изображение. FDLD также можно использовать в сочетании с интеркалирующими флуоресцентными красителями (которые также можно контролировать с помощью УФ-ЛД). Разница в интенсивности, регистрируемая между двумя типами поляризованного света для измерения флуоресценции, пропорциональна сигналу УФ-ЛД, что позволяет использовать DPS для изображения поверхностей.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Бенгт Норден, Элисон Роджер и Тимоти Даффорн Линейный дихроизм и круговой дихроизм. Учебник по спектроскопии поляризованного света. ISBN 978-1-84755-902-9 . Королевское химическое общество – Лондон, 2010 г.
- ^ Хэннон, М.Дж., Морено, В., Прието, М.Дж., Молдерхейм, Э., Слеттен, Э., Мейстерманн, И., Исаак, К.Дж., Сандерс, К.Дж., Роджер, А. «Внутримолекулярное скручивание ДНК, опосредованное металло-супрамолекулярным цилиндр» Angewandte Chemie, 2001, 40, 879−884.
- ^ Элейн Смолл, Рэйчел Маррингтон, Элисон Роджер, Дэвид Дж. Скотт, Кэтрин Слоан, Дэвид Ропер, Тимоти Р. Даффорн и Стивен Г. Аддиналл. Объединение полимеров FtsZ с помощью ортолога ZapA Escherichia coli, YgfE, включает конформационное изменение в связанных GTP' 2007, Журнал молекулярной биологии, 369: 210-221.
- ^ Элисон Роджер, Рэйчел Маррингтон, Майкл А. Дживс, Мэтью Хикс, Лахари де Алвис, Дэвид Дж. Холсолл и Тимоти Р. Даффорн «Наблюдение за длинными молекулами в растворе: что происходит, когда они подвергаются потоку Куэтта?» 2006, Физическая химия, химическая физика, 8: 3161-3171.
- ^ Хайнц Фальк, Гюнтер Формайр, Леон Маргулис, Стефани Мец и Иегуда Мазур «Исследование линейного дихроизма производных пиррометена, пиррометенона и билатриена abc», 1986, Monatshefte Fur Chemie, 117: 849-858.
- ^ Хикс, MR; Дамианоглу, А.; Роджер, А.; Даффорн, ТР; «Складывание и вставка в мембрану порообразующего пептида грамицидина происходит как согласованный процесс». Журнал молекулярной биологии, 2008, 383, 358-366.
- ^ Габор Штайнбах, Иштван Помози, Отто Зирос, Анико Пэй, Габор В. Хорват, Гёзо Гараб «Визуализация флуоресценции выявила линейный дихроизм стенок растительных клеток в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе» 2008, Цитометрия, часть A, 73A: 202-208.