Кристаллография с разрешением во времени
Кристаллография с временным разрешением использует рентгеновскую кристаллографию для визуализации реакций в четырех измерениях (x, y, z и время). Это позволяет изучать динамические изменения, происходящие, например, в ферментах во время их катализа. Временное измерение учитывается путем запуска интересующей реакции в кристалле до воздействия рентгеновских лучей , а затем сбора дифракционных картин с различными временными задержками. Для изучения этих динамических свойств макромолекул необходимо соблюдение трех критериев; [ 1 ]
- Макромолекула должна быть биологически активной в кристаллическом состоянии.
- Должна быть возможность вызвать реакцию в кристалле
- Интересующее промежуточное соединение должно быть обнаруживаемым, т.е. оно должно иметь разумную концентрацию в кристалле (предпочтительно более 25%).
Это привело к разработке нескольких методов, которые можно разделить на две группы: метод накачки-зонда и методы диффузионного улавливания.
Насос-зонд
[ редактировать ]В методе накачки-зонда реакция сначала инициируется (накачкой) фотолизом (чаще всего лазерным светом), а затем дифракционная картина собирается с помощью рентгеновского импульса (зонда) с определенной временной задержкой. Это позволяет получить множество изображений с разными временными задержками после запуска реакции и тем самым построить хронологическую серию изображений, описывающих события во время реакции. Чтобы получить разумное соотношение сигнал/шум, этот цикл накачки-зонда должен выполняться много раз для каждого пространственного вращения кристалла и много раз для одной и той же временной задержки. Следовательно, реакция, которую нужно изучить с помощью насоса-зонда, должна иметь возможность вернуться к своей исходной конформации после запуска, что позволяет проводить множество измерений на одном и том же образце. Временное разрешение наблюдаемых явлений определяется длительностью зондирующего импульса ( полная ширина на половине максимума ). Все процессы, которые происходят в более быстром временном масштабе, будут усредняться путем свертки интенсивности зондирующего импульса во времени с интенсивностью фактической отражательной способности рентгеновского излучения образца.
Диффузионный захват
[ редактировать ]В методах диффузионного улавливания используются методы диффузии для введения подложек в кристалл, после чего применяются различные методы улавливания, чтобы накопить интересующее промежуточное соединение в кристалле перед сбором дифракционной картины. Эти методы улавливания могут включать изменения pH , [ 2 ] использование ингибитора [ 3 ] или понижение температуры, чтобы замедлить скорость оборота или, возможно, даже полностью остановить реакцию на определенной стадии. Просто запускаю реакцию, а затем мгновенно замораживаю ее, [ 4 ] тем самым его гашение на определенном временном шаге также является возможным методом. Одним из недостатков методов диффузионного улавливания является то, что их можно использовать только для изучения промежуточных продуктов, которые можно улавливать, тем самым ограничивая временное разрешение, которое можно получить с помощью этих методов по сравнению с методом «насос-зонд».
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Хайду, Дж; Нойце, Р; Шегрен, Т; Эдман, К; Сёке, А; Уилмут, Колорадо; Уилмот, CM (2000). «Анализ функций белка в четырех измерениях». Структурная биология природы . 7 (11): 1006–12. дои : 10.1038/80911 . ПМИД 11062553 . S2CID 2264560 .
- ^ Ямасита, Ацуко; Эндо, Хигаси, Цунеюки, Тору; Ода, Дзюн'Ичи, Хироаки (2003). «Захват структуры фермента до инициации реакции: комплексы тропинонредуктаза-II». ". Биохимия . 42 (19): 5566–73. doi : 10.1021/bi0272712 . PMID 12741812 .
- ^ Миллер, Монтана; Бахманн, Бо; Таунсенд, Калифорния; Розенцвейг, AC (2002). «Каталитический цикл β-лактамсинтетазы, наблюдаемый с помощью рентгеновских кристаллографических снимков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 99 (23): 14752–7. Бибкод : 2002PNAS...9914752M . дои : 10.1073/pnas.232361199 . ПМК 137491 . ПМИД 12409610 .
- ^ Фидлер, Э.; Торелл, С; Сандалова Т; Гольбик, Р; Кениг, С; Шнайдер, Г. (2002). «Снимок ключевого промежуточного продукта ферментативного катализа тиамина: кристаллическая структура α-карбаниона (α,β-дигидроксиэтил)-тиаминдифосфата в активном центре транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae» . Труды Национальной академии наук . 99 (2): 591–5. Бибкод : 2002PNAS...99..591F . дои : 10.1073/pnas.022510999 . ПМК 117350 . ПМИД 11773632 .