Анализ заживления ран

Эксперимент по исследованию заживления ран при рабдомиосаркоме , линии раковых клеток.

Анализ заживления ран — это лабораторный метод, используемый для изучения миграции клеток и межклеточного взаимодействия . Это также называется анализом царапин , потому что он выполняется путем нанесения царапин на монослой клеток и получения изображений через регулярные промежутки времени с помощью временного микроскопа. ^[1]^[2]

В частности, это подход к двумерной миграции клеток, позволяющий полуколичественно измерить миграцию клеток листа клеток. ^[3] Эта царапина может быть нанесена различными способами, такими как механическое, термическое или химическое повреждение. ^[4] Целью этой царапины является создание бесклеточной области в надежде побудить клетки мигрировать и закрыть разрыв. Царапинный тест идеален только для типов клеток, которые мигрируют как коллективные эпителиальные листы, и бесполезен для неприкрепившихся клеток. ^[3] В частности, этот анализ не идеален для исследований хемотаксиса . ^[5]

Преимущества и недостатки

Этот лабораторный метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, эти тесты относительно дешевы, относительно просты и позволяют проводить измерения в реальном времени. ^[3] Кроме того, условия тестирования можно легко настроить в соответствии с различными экспериментальными целями. ^[2] Этот подход также позволяет обеспечить решительную направленную миграционную реакцию, упрощая количественную оценку данных. ^[2]

Одним из ограничений этого анализа является возможность несоответствия глубины и размера царапины. Когда царапина выполняется вручную, на ней появляются «рваные» границы, что затрудняет анализ данных. ^[6] Кроме того, повреждение может физически повредить клетки, прилегающие к ране, и создать участки раны неправильного размера. ^[3] Это ограничение постепенно становится менее серьезной проблемой с появлением автоматизированных технологий. Анализы электрического импедансного зондирования клеток используются для предотвращения повреждения клеток в нижележащем внеклеточном матриксе, которое, вероятно, может произойти при использовании методов ручного царапин. ^[3] Кроме того, Woundmaker наносит быстрые и равномерные раны на лунках с различными номерами (96 или 384) и обеспечивает высокую производительность скрининга, что является основным преимуществом для различных медицинских исследований. ^[3]

Несмотря на новую технологию, которая повышает точность и эффективность этого анализа, все еще существуют факторы, которые могут исказить результаты анализа, такие как «скопление клеток», эффекты адгезии клеток/клеток и эффекты матрикса. ^[5] Кроме того, все еще упоминается проблема скопления клеток по краям царапины, что делает плотность клеток неравномерной. ^[7]

Есть некоторые скептики, которые считают, что царапина, созданная во время анализа, не очень точно отражает реальную рану. ^[2] Это, скорее всего, так и есть, поскольку настоящие раны по своей сути более сложны, но этот анализ позволяет оценить коллективные движения клеток в определенных экспериментальных условиях, чтобы дать некоторое представление. ^[2]

Несмотря на то, что метод описывался как простой, он подвергался критике из-за непоследовательности в его применении от одного эксперимента к другому. ^[8]^[2]

Стандартный лабораторный протокол

Описан стандартный подход к проведению этого анализа без использования передовых технологий: ^[5]

Пластинчатые клетки выбора в питательной среде в чашку для визуализации живых клеток или предметное стекло. Важно обеспечить образование монослоя, поскольку комки будут давать неточные результаты из-за неравномерной плотности клеток. Необходимо титрование клеток для определения оптимальной плотности посева.
Когда слияние клеток идеальное, используйте кончик пипетки, чтобы поцарапать рану через весь центр лунки. Как упоминалось ранее, именно здесь вступает в игру потенциальная несогласованность этого анализа. Если царапина сделана вручную, важно убедиться, что рана видна с обеих сторон поля зрения и ее ширина должна составлять около 0,5 мм.
Затем клетки можно поместить под микроскоп с относительным увеличением 20x.
Начните покадровую микроскопию и отрегулируйте параметры в соответствии с разнообразием изучаемых клеток. Быстрорастущим клеткам могут потребоваться более короткие интервалы времени для получения более точной скорости ячеек.

Приложения

Количественный/качественный анализ коллективной миграции клеток в изменяющихся экспериментальных условиях. ^[2]
Анализ межклеточных и межклеточных взаимодействий в отношении миграции клеток. ^[2]
Высокопроизводительные сита для: ^[2]
- Гены миграции раковых клеток
- Малые молекулы
- Открытие лекарств

Метрики для количественной оценки миграции клеток

Скорость миграции клеток: ^[2]

$R_{M}=(W_{i}-W_{f})/t$

где

R _M = Скорость миграции клеток

W _I = начальная ширина раны

W _f = конечная ширина раны

t = продолжительность миграции

Относительная плотность раны: ^[2]

$\%RWD(t)=[(w_{t}-w_{0})/(c_{t}-w_{0})]*100$

где

w _t = плотность площади раны в момент времени t

c _t = Плотность площади ячейки в момент времени t

Выше приведены основные показатели, которые можно измерить с помощью этого анализа. Однако все еще предпринимаются усилия по улучшению интерпретации этого анализа. Были оценены три различных измерения: среднее значение прямой скорости, среднее значение скорости регрессии и средняя скорость регрессии на расстоянии. ^[9] Средняя скорость прямой регрессии и средняя скорость регрессии на расстоянии были более устойчивы к выбросам, тогда как средняя скорость регрессии была более чувствительна к выбросам. ^[9]

Миграция клеток

Царапинный анализ — отличный инструмент для изучения миграции клеток , поскольку этот механизм участвует во многих различных физиологических аспектах. ^[7] Миграция клеток играет огромную роль в реэпителизации кожи, поэтому изучение миграции клеток может способствовать улучшению понимания незаживающих ран. ^[7] Миграция клеток также имеет фундаментальное значение в таких процессах развития, как гаструляция и органогенез. ^[9] Миграция клеток также участвует в иммунных реакциях и метастазах рака. ^[7]

Биология рака

С развитием технологий этот анализ становится очень полезным, особенно в области биологии рака. Исследование было проведено, чтобы лучше понять роль, которую клаудин-7, семейство белков с плотными соединениями, играет в миграции клеток в типе клеток рака легких человека. ^[10] Из-за более медленной скорости миграции нокдаун-клеток клаудина-7 это подтверждает идею о том, что этот белок важен для миграции клеток и способности клеток метастазировать. ^[10] Клетки подвергаются листовой миграции из-за множества сигналов и механизмов при попытке закрыть рану, что, как полагают, аналогично механизмам, лежащим в основе метастазирования. ^[4]

Альтернативы анализу заживления ран

Используя устройства для визуализации живых клеток без меток, основанные на количественной фазовой визуализации , было показано, что подвижность клеток сильно коррелирует с заживлением ран и результатами трансвеллового анализа. Преимущество этого полностью автоматизированного подхода заключается в том, что количественная оценка подвижности клеток не требует специальной подготовки проб, что позволяет пролиферации клеток . одновременно проводить количественную оценку ^[11]^[12]

Ссылки

^ Родригес Л.Г., Ву X, Гуань Дж.Л. (2005). «Ранозаживляющий анализ». Миграция клеток . Методы молекулярной биологии. Том. 294. стр. 23–9. дои : 10.1385/1-59259-860-9:023 . ISBN 1-59259-860-9 . ПМИД 15576902 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к Града А, Отеро-Винас М, Прието-Кастрильо Ф, Обаги З, Фаланга В (февраль 2017 г.). «Методы исследования стали проще: анализ коллективной миграции клеток с использованием анализа заживления ран» . Журнал исследовательской дерматологии . 137 (2): e11–e16. дои : 10.1016/j.jid.2016.11.020 . ПМИД 28110712 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Берроуз А., Пирсон Х.Б., Пулио Н. (2013). Исследование метастазов с использованием платформ in vitro . Ландес Бионаука.
^ Перейти обратно: ^а ^б Джонкман Дж. Э., Кэткарт Дж. А., Сюй Ф, Бартолини М. Е., Амон Дж. Э., Стивенс К. М., Коларуссо П. (октябрь 2014 г.). «Введение в анализ заживления ран с использованием микроскопии живых клеток» . Адгезия и миграция клеток . 8 (5): 440–51. дои : 10.4161/cam.36224 . ПМК 5154238 . ПМИД 25482647 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Кори Дж. (2011). «Царапинно-раневой анализ». Миграция клеток . Методы молекулярной биологии. Том. 769. стр. 25–30. дои : 10.1007/978-1-61779-207-6_2 . ISBN 978-1-61779-206-9 . ПМИД 21748666 .
^ Де Иесо М.Л., Пей СП (октябрь 2018 г.). «Точный и экономически эффективный альтернативный метод измерения миграции клеток с помощью анализа циркулярного закрытия раны» . Отчеты по биологическим наукам . 38 (5): BSR20180698. дои : 10.1042/BSR20180698 . ПМК 6209583 . ПМИД 30232234 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Ванг Муритцен М., Йенссен Х. (август 2018 г.). «Оптимизированный скретч-анализ для тестирования миграции клеток in vitro с помощью автоматизированной оптической камеры» . Журнал визуализированных экспериментов (138). дои : 10.3791/57691 . ПМК 6126681 . ПМИД 30148500 .
^ Джонкман Дж. Э., Кэткарт Дж. А., Сюй Ф., Бартолини М. Е., Амон Дж. Э., Стивенс К. М., Коларуссо П. (сентябрь 2014 г.). «Введение в анализ заживления ран с использованием микроскопии живых клеток» . Адгезия и миграция клеток . 8 (5): 440–51. дои : 10.4161/cam.36224 . ПМК 5154238 . ПМИД 25482647 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Диллон П.К., Ли Икс, Санес Дж.Т., Акинтола ОС, Сан Б (июнь 2017 г.). «Сравнение методов анализа скорости заживления ран». Биохимия и клеточная биология . 95 (3): 450–454. дои : 10.1139/bcb-2016-0163 . hdl : 1807/78300 . ПМИД 28177756 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Ким Д.Х., Лу Ц, Чен Ю.Х. (март 2019 г.). «Клаудин-7 модулирует адгезию клеток с матриксом, которая контролирует миграцию, инвазию и прикрепление клеток рака легких человека HCC827» . Письма об онкологии . 17 (3): 2890–2896. дои : 10.3892/ol.2019.9909 . ПМК 6365970 . ПМИД 30854065 .
^ Чжан, Юньтянь; Джадсон, Роберт Л. (ноябрь 2018 г.). «Оценка применения голомонитора подвижности М4 с голографической визуализацией» . Цитометрия Часть А. 93 (11): 1125–1131. doi : 10.1002/cyto.a.23635 . ПМЦ 7819361 . ПМИД 30343513 .
^ Цзэн, Ханлинь; Джорапур, Апарна; Шейн, А. Хантер; Ланг, Урсула Э.; Торрес, Родриго; Чжан, Юньтянь; Макнил, Эндрю С.; Боттон, Томас; Лин, Цзюй; Донн, Мэтью; Бастиан, Ингмар Н.; Ю, Ричард; Норт, Джеффри П.; Пинкус, Лаура; Рубен, Бет С.; Джозеф, Нэнси М.; Да, Ивэй; Бастиан, Борис К.; Джадсон, Роберт Л. (июль 2018 г.). «Биаллельная потеря CDKN2A инициирует инвазию меланомы посредством активации BRN2» . Раковая клетка . 34 (1): 56–68.e9. doi : 10.1016/j.ccell.2018.05.014 . ПМК 6084788 . ПМИД 29990501 .

[Rodriguez_205-1] Родригес Л.Г., Ву X, Гуань Дж.Л. (2005). «Ранозаживляющий анализ». Миграция клеток . Методы молекулярной биологии. Том. 294. стр. 23–9. дои : 10.1385/1-59259-860-9:023 . ISBN 1-59259-860-9 . ПМИД 15576902 .

[Grada_2017-2] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к Града А, Отеро-Винас М, Прието-Кастрильо Ф, Обаги З, Фаланга В (февраль 2017 г.). «Методы исследования стали проще: анализ коллективной миграции клеток с использованием анализа заживления ран» . Журнал исследовательской дерматологии . 137 (2): e11–e16. дои : 10.1016/j.jid.2016.11.020 . ПМИД 28110712 .

[Burrows_2013-3] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Берроуз А., Пирсон Х.Б., Пулио Н. (2013). Исследование метастазов с использованием платформ in vitro . Ландес Бионаука.

[Jonkman_2014-4] Перейти обратно: ^а ^б Джонкман Дж. Э., Кэткарт Дж. А., Сюй Ф, Бартолини М. Е., Амон Дж. Э., Стивенс К. М., Коларуссо П. (октябрь 2014 г.). «Введение в анализ заживления ран с использованием микроскопии живых клеток» . Адгезия и миграция клеток . 8 (5): 440–51. дои : 10.4161/cam.36224 . ПМК 5154238 . ПМИД 25482647 .

[Cory_2011-5] Перейти обратно: ^а ^б ^с Кори Дж. (2011). «Царапинно-раневой анализ». Миграция клеток . Методы молекулярной биологии. Том. 769. стр. 25–30. дои : 10.1007/978-1-61779-207-6_2 . ISBN 978-1-61779-206-9 . ПМИД 21748666 .

[6] Де Иесо М.Л., Пей СП (октябрь 2018 г.). «Точный и экономически эффективный альтернативный метод измерения миграции клеток с помощью анализа циркулярного закрытия раны» . Отчеты по биологическим наукам . 38 (5): BSR20180698. дои : 10.1042/BSR20180698 . ПМК 6209583 . ПМИД 30232234 .

[Vang_Mouritzen_2018-7] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Ванг Муритцен М., Йенссен Х. (август 2018 г.). «Оптимизированный скретч-анализ для тестирования миграции клеток in vitro с помощью автоматизированной оптической камеры» . Журнал визуализированных экспериментов (138). дои : 10.3791/57691 . ПМК 6126681 . ПМИД 30148500 .

[CAM-8] Джонкман Дж. Э., Кэткарт Дж. А., Сюй Ф., Бартолини М. Е., Амон Дж. Э., Стивенс К. М., Коларуссо П. (сентябрь 2014 г.). «Введение в анализ заживления ран с использованием микроскопии живых клеток» . Адгезия и миграция клеток . 8 (5): 440–51. дои : 10.4161/cam.36224 . ПМК 5154238 . ПМИД 25482647 .

[Dhillon_2017-9] Перейти обратно: ^а ^б ^с Диллон П.К., Ли Икс, Санес Дж.Т., Акинтола ОС, Сан Б (июнь 2017 г.). «Сравнение методов анализа скорости заживления ран». Биохимия и клеточная биология . 95 (3): 450–454. дои : 10.1139/bcb-2016-0163 . hdl : 1807/78300 . ПМИД 28177756 .

[Kim_2019-10] Перейти обратно: ^а ^б Ким Д.Х., Лу Ц, Чен Ю.Х. (март 2019 г.). «Клаудин-7 модулирует адгезию клеток с матриксом, которая контролирует миграцию, инвазию и прикрепление клеток рака легких человека HCC827» . Письма об онкологии . 17 (3): 2890–2896. дои : 10.3892/ol.2019.9909 . ПМК 6365970 . ПМИД 30854065 .

[11] Чжан, Юньтянь; Джадсон, Роберт Л. (ноябрь 2018 г.). «Оценка применения голомонитора подвижности М4 с голографической визуализацией» . Цитометрия Часть А. 93 (11): 1125–1131. doi : 10.1002/cyto.a.23635 . ПМЦ 7819361 . ПМИД 30343513 .

[12] Цзэн, Ханлинь; Джорапур, Апарна; Шейн, А. Хантер; Ланг, Урсула Э.; Торрес, Родриго; Чжан, Юньтянь; Макнил, Эндрю С.; Боттон, Томас; Лин, Цзюй; Донн, Мэтью; Бастиан, Ингмар Н.; Ю, Ричард; Норт, Джеффри П.; Пинкус, Лаура; Рубен, Бет С.; Джозеф, Нэнси М.; Да, Ивэй; Бастиан, Борис К.; Джадсон, Роберт Л. (июль 2018 г.). «Биаллельная потеря CDKN2A инициирует инвазию меланомы посредством активации BRN2» . Раковая клетка . 34 (1): 56–68.e9. doi : 10.1016/j.ccell.2018.05.014 . ПМК 6084788 . ПМИД 29990501 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]