Денатурирование высокопроизводительной жидкой хроматографии

Денатурирование высокопроизводительной жидкой хроматографии (DHPLC) является методом хроматографии для обнаружения оснований, небольших удалений или вставки в ДНК. Из -за своей скорости и высокого разрешения этот метод особенно полезен для поиска полиморфизмов в ДНК.

На практике анализ начинается со стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР), чтобы усилить интересный фрагмент. Если амплифицированная область, которая проявляет полиморфизм (ы), является гетерозиготной , в продукте ПЦР будут присутствовать два вида фрагментов, соответствующих аллелю и дикому полиморфному аллелю. За этим первым шагом следует этап денатурации-подачи для создания гетеро- и гомодуплексов из двух популяций аллелей в ПЦР. Чтобы найти гомозиготный полиморфизм, пройдите таким же образом, предварительно смешивая дикую популяцию ДНК в популяцию полиморфной ДНК для получения гетеродуплексов после стадии денатурации -подачи.

Гетеродуплексы на самом деле представляют собой двойные пряди ДНК, содержащую прядь от аллеля дикого типа, и веточка из полиморфного аллеля. Образование таких фрагментов ДНК затем вызывает появление «несоответствия» или плохого спаривания, где расположен полиморфизм.

Эти «несоответствия» в гетеродуплексе являются основой для обнаружения полиморфизма с помощью DHPLC. Гетеродуплексы являются термически менее стабильными, чем их соответствующие гомодуплексы, и, следовательно, отдельные пряди ДНК будут отключены хроматографией при подверженной достаточно высокой температуре. Следствием этой нестабильности двойной цепи будет несоответствие двух цепей ДНК в области полиморфизма, когда ДНК нагревается до температуры плавления ДНК . Следовательно, это несоответствие уменьшит взаимодействие с колонкой и приведет к сокращению времени удержания по сравнению с гомодуплексами в процессе хроматографического разделения.

Чтобы наблюдать за явлением разделения, метод DHPLC использует колонку невидимой пористой стационарной фазы, состоящей из полистирола - дивинилбензол алкил. Стационарная фаза электрически нейтральная и гидрофобная . ДНК, однако, отрицательно заряжается в ее фосфатных группах и, следовательно, может адсорбировать себя на колонке. Чтобы сделать возможной адсорбцию , ацетат триэтиламмония используется (TEAA). Положительно заряженный ион аммония этих молекул взаимодействует с ДНК, а алкильная цепь с гидрофобной поверхностью твердой фазы.

Следовательно, когда гетеродуплексы частично денатурируются нагреванием, отрицательные заряды подвергаются частичным перемещению, а сила взаимодействия между гетеродуплексами ДНК и колонкой уменьшается по сравнению с силой взаимодействия гомодуплексов. Следовательно, они будут менее быстро элюированы подвижной фазой (состоящей из ацетонитрила ).