Электрофоретическое рассеяние света

Электрофоретическое рассеяние света (также известное как лазерный доплеровский электрофорез и фазовый анализ рассеяния света ) основано на динамическом рассеянии света . Сдвиг частоты подвижности дисперсных или фазовый сдвиг падающего лазерного луча зависит от частиц . При динамическом рассеянии света броуновское движение вызывает движение частиц. При электрофоретическом рассеянии света колеблющееся электрическое поле эту функцию выполняет .

Этот метод используется для измерения электрофоретической подвижности , на основании которой зета-потенциал затем можно рассчитать . Инструменты для применения метода коммерчески доступны от нескольких производителей. Для последней серии расчетов необходима информация о вязкости и диэлектрической проницаемости дисперсионной среды ; соответствующая теория электрофореза также необходима . Разбавление образца часто необходимо для устранения многократного рассеяния падающего лазерного луча и/или взаимодействия частиц.

Инструментарий

Рис.3. Коммерческая гетеродинная оптическая система электрофоретического светорассеивающего прибора с модулятором (из работы 11).

Лазерный луч проходит через ячейку для электрофореза, облучает диспергированные в ней частицы и рассеивается ими. Рассеянный свет регистрируется фотоумножителем после прохождения через два отверстия. Существует два типа оптических систем: гетеродинные и интерференционные.Посуда и флюгер разработал прибор ЭЛС гетеродинного типа, который стал первым прибором такого типа. В приборе ELS с периферийной оптикой, лазерный луч разделяется на два луча. Они пересекаются внутри электрофрезической ячейки под фиксированным углом, образуя узор бахромы. Рассеянный свет частиц, мигрирующий внутрь полосы, модулируется по интенсивности. Сдвиги частоты обоих типов оптики подчиняются одним и тем же уравнениям. Наблюдаемые спектры похожи друг на друга.Ока и др. разработал прибор ЭЛС гетеродинной оптики. который теперь доступен коммерчески. Его оптика показана на рис. 3.

Если частоты пересекающихся лазерных лучей одинаковы, то невозможно определить направление движения мигрирующих частиц. Вместо этого можно определить только величину скорости (т.е. скорость). Следовательно, знак дзета-потенциала не может быть установлен. Это ограничение можно преодолеть, сместив частоту одного из лучей относительно другого. Такое смещение можно назвать частотной модуляцией или, проще говоря, просто модуляцией. Модуляторы, используемые в ELS, могут включать в себя зеркала с пьезоприводом или акустооптические модуляторы. Эта схема модуляции используется и в методе гетеродинного светорассеяния.

Фазовый анализ рассеяния света (PALS) — это метод оценки дзета-потенциала, при котором анализируется скорость изменения фазы интерференции между светом, рассеянным образцом, и модулированным опорным лучом. Эта скорость сравнивается с математически сгенерированной синусоидальной волной, заданной частотой модулятора. Применение больших полей, которые могут привести к нагреву образца и разрушению коллоидов, больше не требуется. Но любая нелинейность модулятора или любое изменение характеристик модулятора со временем будет означать, что генерируемая синусоидальная волна больше не будет отражать реальные условия, и результирующие измерения дзета-потенциала станут менее надежными.

Дальнейшим развитием метода PALS является так называемый метод «PALS с постоянным контролем» (cmPALS), который устраняет нелинейность модуляторов. Дополнительный модулятор обнаруживает интерференцию между модулированным и немодулированным лазерным светом. Таким образом, его частота биений является исключительно частотой модуляции и, следовательно, не зависит от электрофоретического движения частиц. Это приводит к более быстрым измерениям, более высокой воспроизводимости даже при слабых электрических полях, а также более высокой чувствительности измерения.

Гетеродинное светорассеяние

Частота света, рассеиваемого частицами, подвергающимися электрофорезу, смещается на величину эффекта Доплера, $\upsilon _{D}\,$ от падающего света: $\upsilon \,$ .Сдвиг можно обнаружить с помощью гетеродинной оптики, в которой рассеивающий свет смешивается с опорным светом.Автокорреляционная функция интенсивности смешанного света, $g(\tau )\,$, может быть приближенно описана следующей функцией затухающего косинуса [7].

$g(\tau )=A+B\exp(-\Gamma \tau )\cos(2\pi \upsilon _{o})+C\exp(-2\Gamma \tau )\,\qquad (1)$

где $\Gamma \,$ — константа распада, а A, B и C — положительные константы, зависящие от оптической системы.

Частота демпфирования $\upsilon _{o}\,$ — наблюдаемая частота, а также разность частот между рассеянным и опорным светом.

$\upsilon _{o}=|\upsilon _{s}-\upsilon _{r}|=|(\upsilon _{i}+\upsilon _{D})-(\upsilon _{i}+\upsilon _{M})|\qquad (2)$

где $\upsilon _{s}\,$ - частота рассеянного света, $\upsilon _{r}\,$ частота опорного света, $\upsilon _{i}\,$ частота падающего света (лазерного света),и $\upsilon _{M}\,$ частота модуляции.

Спектр мощности смешанного света, а именно преобразование Фурье $g(\tau )\,$, дает пару функций Лоренца в $\pm \Delta \upsilon \,$ имеющий полуширину $\Gamma /2\pi \,$ на половине максимума.

В дополнение к этим двум последний член в уравнении (1) дает еще одну функцию Лоренца при $\upsilon =0\,$

Доплеровский сдвиг частоты и константа затухания зависят от геометрии оптической системы и выражаются соответственно уравнениями.

$\upsilon _{D}={\frac {Vq}{2\pi }}\qquad (3)$

и

$\Gamma =D|q|^{2}\qquad (4)$

где $\ V\,$ - скорость частиц, $\ q\,$ – амплитуда вектора рассеяния, $\ D\,$ – константа поступательной диффузии частиц.

Амплитуда вектора рассеяния $\ q\,$ задается уравнением

$\ |q|={\frac {4\pi n}{\lambda _{0}}}\sin \left({\frac {\theta }{2}}\right)\qquad (5)$

Поскольку скорость $\ V\,$ пропорциональна приложенному электрическому полю, $\ E\,$, кажущаяся электрофоретическая подвижность $\ \mu _{obs}\,$ определяется уравнением

$\ {\vec {V}}=\mu _{obs}{\vec {E}}\qquad (6)$

Наконец, связь между частотой доплеровского сдвига и подвижностью для случая оптической конфигурации рис. 3 дается уравнением

$\upsilon _{D}=\mu _{obs}{\frac {nE}{\lambda _{0}}}\sin \theta \qquad (7)$

где $\ E\,$ - напряженность электрического поля, $\ n\,$ показатель преломления среды, $\ \lambda _{0}\,$, длина волны падающего света в вакууме и $\ \theta \,$ угол рассеяния.Знак $\ v_{D}\,$ является результатом векторного расчета и зависит от геометрии оптики.

Спектральную частоту можно получить по формуле. (2).Когда $\ |\upsilon _{M}|>|\upsilon _{D}|\,$, уравнение (2) модифицируется и выражается как

$\upsilon _{p}=\upsilon _{o}=\pm (\upsilon _{D}-|\upsilon _{M}|)\qquad (8)$

Частота модуляции $\upsilon _{M}\,$ может быть получена как частота затухания без приложения электрического поля.

Диаметр частицы получают, предполагая, что частица имеет сферическую форму. Это называется гидродинамическим диаметром, $\ d_{H}\,$ .

$\ d_{H}={\frac {k_{B}T}{3\pi \eta D}}\qquad (10)$

где $\ k_{B}\,$ – коэффициент Больцмана , $\ T\,$ - абсолютная температура, а $\ \eta \,$ динамическая вязкость окружающей жидкости.

Профиль электроосмотического потока

На рис. 4 представлены два примера гетеродинных автокорреляционных функций рассеянного света раствора полистиролсульфата натрия (NaPSS; молекулярная масса 400 000; 4 мг/мл в 10 мМ NaCl). Осциллирующая корреляционная функция, показанная на рис. 4а, является результатом интерференции рассеянного света и модулированного опорного света.В биение рис. 4б дополнительно включен вклад изменения частоты света, рассеянного молекулами ПСС под действием электрического поля 40 В/см.

На рис. 5 показаны спектры мощности гетеродина, полученные методом Фурье-преобразования автокорреляционных функций, представленных на рис. 4.

На рисунке 6 показаны графики частот доплеровского сдвига, измеренных при различной глубине ячейки и напряженности электрического поля, где образцом является раствор NaPSS.Эти параболические кривые называются профилями электроосмотического потока и указывают на то, что скорость частиц менялась на разной глубине.Поверхностный потенциал клеточной стенки создает электроосмотический поток.Поскольку камера электрофореза представляет собой закрытую систему, обратный поток создается в центре ячейки.Тогда наблюдаемая подвижность или скорость из уравнения. (7) является результатом сочетания осмотического потока и электрофоретического движения.

Анализ электрофоретической подвижности изучали Мори и Окамото [16], которые учли эффект электроосмотического потока на боковой стенке.

Профиль скорости или подвижности в центре ячейки приблизительно определяется уравнением. (11) для случая k>5.

$\ U_{a}(z)=AU_{0}(z/b)^{2}+\Delta U_{0}(z/b)+(1-A)U_{0}+U_{p}\qquad (11)$

где

$\ z=\,$ глубина ячейки

$\ U_{a}(z)=\,$ кажущаяся электрофоретическая скорость частицы в положении z.

$\ U_{p}=\,$ истинная электрофоретическая скорость частиц.

$\ z/b=\,$ толщина ячейки

$\ U_{0}=\,$ средняя скорость осмотического потока на верхней и нижней клеточной стенке.

$\Delta U_{0}=\,$ разница между скоростями осмотического потока на верхней и нижней клеточной стенке.

$\ A={\frac {1}{(2/3)-(0.420166/k)}}\qquad (12)$

$\ k=a/b\,$ , отношение длин двух сторон прямоугольного поперечного сечения.

Параболическая кривая сдвига частоты, вызванная электроосмотическим потоком, показанная на рис. 6, соответствует уравнению. (11) с применением метода наименьших квадратов.

Поскольку подвижность пропорциональна сдвигу частоты света, рассеянного частицей, и скорости миграции частицы, как указано в уравнении. В (7) все сдвиги скорости, подвижности и частоты выражаются параболическими уравнениями.Затем получают истинную электрофоретическую подвижность частицы, электроосмотическую подвижность верхней и нижней клеточных стенок.Сдвиг частоты, вызванный только электрофорезом частиц, равен кажущейся подвижности в неподвижном слое.

Полученная таким образом скорость электрофоретической миграции пропорциональна электрическому полю, как показано на рис. 7.Сдвиг частоты увеличивается с увеличением угла рассеяния, как показано на рис. 8.Этот результат согласуется с теоретическим уравнением. (7).

• 
  фиг.4 а и б; Корреляционная функция с электрическим полем и без него. Образец: раствор NaPSS (ММ: 400 000) 4 мг/мл в 10 мМ NaCl. Приложенное электрическое поле: (а) 0 В/см; (б) 40 В/см. Угол рассеяния 7,0 градусов, температура 25 +-0,3.
• 
  Рис. 5. Спектры мощности гетеродина, полученные методом БПФ корреляционных функций.
• 
  Рис. 6. Сдвиги частот, наблюдаемые на различной глубине ячейки.
• 
  Рис. 7. Зависимость скорости от электрического поля в неподвижном слое.
• 
  Рис. 8. Сдвиг частоты в зависимости от угла рассеяния.

Приложения

Электрофоретическое рассеяние света (ELS) в основном используется для характеристики поверхностных зарядов коллоидных частиц, таких как макромолекулы или синтетические полимеры (например, полистирол). ) в жидких средах в электрическом поле. Помимо информации о поверхностных зарядах, ELS также может измерять размер частиц белков. и определить распределение зета-потенциала .

Биофизика

ELS полезен для характеристики информации о поверхности белков. Ware и Flygare (1971) продемонстрировали, что электрофоретические методы можно сочетать со спектроскопией лазерных ударов для одновременного определения электрофоретической подвижности и коэффициента диффузии бычьего сывороточного альбумина . Ширина доплеровского спектра света, рассеянного раствором макромолекул, пропорциональна коэффициенту диффузии . Доплеровский сдвиг пропорционален электрофоретической подвижности макромолекулы. Судя по исследованиям, в которых этот метод применялся к поли (L-лизину) , предполагается, что ELS отслеживает колебания подвижности в присутствии растворителей с различными концентрациями солей. Также было показано, что данные электрофоретической подвижности можно преобразовать в значения зета-потенциала , что позволяет определять изоэлектрическую точку белков и количество электрокинетических зарядов на поверхности.

Другие биологические макромолекулы, которые можно анализировать с помощью ELS, включают полисахариды . Значения pKa хитозанов можно рассчитать по зависимости значений электрофоретической подвижности от pH и плотности заряда. Как и белки, размер и зета-потенциал хитозанов можно определить с помощью ELS.

ELS также применялся к нуклеиновым кислотам и вирусам. Этот метод можно расширить для измерения электрофоретической подвижности крупных молекул бактерий при низкой ионной силе.

Наночастицы

ELS использовался для характеристики полидисперсности , нанодисперсности и стабильности одностенных углеродных нанотрубок в водной среде с поверхностно-активными веществами. Этот метод можно использовать в сочетании с динамическим рассеянием света для измерения свойств нанотрубок во многих различных растворителях.

Ссылки

(1) Серия «Наука о поверхностно-активных веществах», редактор-консультант Мартин Дж. Шик, консультант, Нью-Йорк, Vol. 76 Электрические явления на интерфейсах Второе издание, Основы, измерения и приложения, Второе издание, переработанное и расширенное. Под редакцией Хироюки Осима, Кунио Фурусава. 1998. К. Ока и К. Фурусава, Глава 8. Электрофрез, с. 152 - 223. Марсель Деккер, Инк,

(7) Б. Р. Уэр и Д. Д. Хаас, «Быстрый метод в физической биохимии и клеточной биологии». (Р.И. Шаафи и С.М. Фернандес, ред.), Elsevier, Нью-Йорк, 1983, гл. 8.

(9) Уэр, БР; Флайгар, штат Вашингтон (1972). «Светорассеяние в смесях БСА, димеров БСА и фибриногена под действием электрических полей». Журнал коллоидной и интерфейсной науки . 39 (3). Эльзевир Б.В.: 670–675. дои : 10.1016/0021-9797(72)90075-6 . ISSN   0021-9797 .

(10) Йозефович, Дж.; Халлетт, Франция (1 марта 1975 г.). «Гомодинное электрофоретическое рассеяние света полистироловыми сферами с помощью корреляции интенсивности перекрестного лазерного луча». Прикладная оптика . 14 (3). Оптическое общество: 740. doi : 10.1364/ao.14.000740 . ISSN   0003-6935 .

(11) К. Ока, В. Отани, К. Камеяма, М. Кидай и Т. Такаги, Appl. Теор. Электрофор. 1: 273-278 (1990).

(12) K. Oka, W. Otani, Y. Kubo, Y. Zasu, and M. Akagi, U.S. Patent Appl. 465, 186: Jpn. Patent H7-5227 (1995).

(16) С. Мори и Х. Окамото, Флотация 28:1 (1980). (на японском языке): Fusen 28(3): 117 (1980).

(17) М. Смолуховский, в Справочнике по электричеству и магнетизму. (Л. Грейц. Ред.). Барт, Лерипциг, 1921, стр. 379.

(18) П. Уайт, Фил. Маг. С 7, 23, № 155 (1937).

(19) С. Комагат, Рез. Электротех. Лаб. (Япония) 348, март 1933 г.

(20) Ю. Фукуи, С. Юу и К. Ушики, Power Technol. 54: 165 (1988).