Детский анализ
C 0 t анализ , метод, основанный на принципах кинетики реассоциации ДНК , представляет собой биохимический метод, который измеряет количество повторяющейся ДНК в образце ДНК, таком как геном . [ 1 ] Он используется для изучения структуры и организации генома , а также для упрощения секвенирования геномов, содержащих большое количество повторяющихся последовательностей. [ 2 ]
Процедура
[ редактировать ]Процедура включает в себя нагревание образца геномной ДНК до тех пор, пока он не превратится в одноцепочечную форму, а затем медленное его охлаждение, чтобы нити могли снова соединиться. Пока образец охлаждается, измеряется количество спаренных оснований ДНК при каждой температуре.
Количество одно- и двухцепочечной ДНК измеряется путем быстрого разведения образца, что замедляет реассоциацию, а затем связывания ДНК с колонкой с гидроксиапатитом . Колонку сначала промывают натрий-фосфатным буфером низкой концентрации, элюирующим одноцепочечную ДНК, а затем фосфатом высокой концентрации, элюирующим двухцепочечную ДНК. Затем количество ДНК в этих двух растворах измеряют с помощью спектрофотометра .
Анализ
[ редактировать ]Поскольку последовательность одноцепочечной ДНК должна найти комплементарную цепь для образования двойной спирали, обычные последовательности ренатурируются быстрее, чем редкие последовательности. Действительно, скорость реассоциации последовательности пропорциональна количеству копий этой последовательности в образце ДНК. Образец с часто повторяющейся последовательностью будет ренатурироваться быстро, тогда как сложные последовательности будут ренатурироваться медленно.
Однако вместо простого измерения процентного содержания двухцепочечной ДНК в зависимости от времени, степень ренатурации измеряется относительно значения C 0 t. Величина C 0 t представляет собой произведение C 0 (начальной концентрации ДНК), t (времени в секундах) и константы, зависящей от концентрации катионов в буфере. Повторяющаяся ДНК будет ренатурироваться при низких значениях C0t , тогда как сложные и уникальные последовательности ДНК будут ренатурироваться при высоких значениях C0t . Быстрая ренатурация повторяющейся ДНК обусловлена наличием многочисленных комплементарных последовательностей.
Применение к секвенированию генома
[ редактировать ]C0t эукариотических -фильтрация — это метод, который использует принципы кинетики ренатурации ДНК для отделения повторяющихся последовательностей ДНК , которые доминируют во многих геномах , от «богатых генами» одиночных/малокопийных последовательностей. [ 2 ] Это позволяет секвенированию ДНК сконцентрироваться на наиболее информативных и интересных частях генома, что ускорит открытие новых генов и сделает процесс более эффективным. [ 3 ] [ 4 ]
История
[ редактировать ]Впервые он был разработан и использован Роем Бриттеном и его коллегами из Института Карнеги в Вашингтоне в 1960-х годах. [ 5 ] [ 6 ] Особо следует отметить, что именно с помощью C 0 t-анализа была впервые обнаружена избыточная (повторяющаяся) природа эукариотических геномов. [ 7 ] Однако только после революционных экспериментов по кинетике реассоциации ДНК, проведенных Бриттеном и его коллегами, было показано, что не вся ДНК кодирует гены. Фактически, их эксперименты показали, что большая часть геномной ДНК эукариот состоит из повторяющихся некодирующих элементов. [ 1 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Уоринг М., Бриттен Р.Дж. (1966). «Повторение нуклеотидной последовательности: быстро реассоциирующаяся фракция мышиной ДНК». Наука . 154 (3750): 791–4. Бибкод : 1966Sci...154..791W . дои : 10.1126/science.154.3750.791 . ПМИД 5919450 . S2CID 39686808 .
- ^ Jump up to: а б Петерсон Д.Г., Весслер С.Р., Патерсон А.Х. (2002). «Эффективный захват уникальных последовательностей из геномов эукариот». Тенденции Жене . 18 (11): 547–50. дои : 10.1016/S0168-9525(02)02764-6 . ПМИД 12414178 .
- ^ Л Ламуре Д., Петерсон Д.Г., Ли В., Феллерс Дж.П., Гилл Б.С. (2005). «Эффективность обогащения генов пшеницы (Triticum aestivum L.) на основе Cot» . Геном . 48 (6): 1120–6. дои : 10.1139/g05-080 . ПМИД 16391681 . Архивировано из оригинала 7 июля 2012 г. Проверено 24 февраля 2008 г.
- ^ Юань Ю, СанМигель П.Дж., Беннетцен Дж.Л. (2003). «Анализ последовательности генома кукурузы High-Cot» . Плант Дж . 34 (2): 249–55. дои : 10.1046/j.1365-313X.2003.01716.x . ПМИД 12694599 .
- ^ Дэвидсон Э.Х., Бриттен Р.Дж. (1973)Организация, транскрипция и регуляция в геноме животных. Кварта. Преподобный биол. 48: 565-613.
- ^ Бриттен Р.Дж., Грэм Д.Э., Нойфельд Б.Р. (1974). «Анализ повторяющихся последовательностей ДНК методом реассоциации» . Нуклеиновые кислоты и синтез белка . Часть E. Методы энзимологии. Том. 29. С. 363–418 . дои : 10.1016/0076-6879(74)29033-5 . ISBN 978-0-12-181892-0 . ПМИД 4850571 .
- ^ Бриттен Р.Дж., Коне Д.Э. (1968). «Повторяющиеся последовательности в ДНК». Наука . 161 (841): 529–540. Бибкод : 1968Sci...161..529B . дои : 10.1126/science.161.3841.529 . ПМИД 4874239 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Кот-анализ: обзор Лаборатории исследования генома Миссисипи