Флуоресцентно-интерференционно-контрастная микроскопия

Флуоресцентно-интерференционная контрастная микроскопия (FLIC) — это микроскопический метод, разработанный для достижения z-разрешения в нанометровом масштабе.

FLIC возникает всякий раз, когда флуоресцентные объекты находятся вблизи отражающей поверхности (например, кремниевая пластина). Возникающая интерференция прямого и отраженного света приводит к двойному греху. ² модуляция интенсивности I флуоресцентного объекта в зависимости от расстояния h над отражающей поверхностью. Это позволяет проводить измерения высоты нанометров .

Микроскоп FLIC хорошо подходит для измерения топографии мембран, содержащих флуоресцентные зонды, например, искусственный липидный бислой , мембрана живой клетки или структура флуоресцентно меченных белков на поверхности.

Оптическая теория FLIC

Общая двухслойная система

Оптическая теория, лежащая в основе FLIC, была разработана Армином Ламбахером и Питером Фромхерцем. Они установили зависимость между наблюдаемой интенсивностью флуоресценции и расстоянием флуорофора от отражающей поверхности кремния .

Наблюдаемая интенсивность флуоресценции, $I_{FLIC}$, – произведение вероятности возбуждения в единицу времени, $P_{ex}$, и вероятность измерения испускаемого фотона в единицу времени, $P_{em}$. Обе вероятности являются функцией высоты флуорофора над поверхностью кремния, поэтому наблюдаемая интенсивность также будет функцией высоты флуорофора. Самая простая конструкция, которую следует рассмотреть, — это флуорофор, встроенный в диоксид кремния (показатель преломления $n_{1}$) расстояние d от границы раздела с кремнием (показатель преломления $n_{0}$). Флуорофор возбуждается светом с длиной волны $\lambda _{ex}$ и излучает свет с длиной волны $\lambda _{em}$. Единичный вектор $''e_{ex}''$ дает ориентацию переходного диполя возбуждения флуорофора. $P_{ex}$ пропорционален квадрату проекции локального электрического поля , $F_{in}$, включающий влияние интерференции , на направление переходного диполя.
$P_{ex}\propto \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}$
Локальное электрическое поле, $F_{in}$, на флуорофор влияет интерференция между прямым падающим светом и светом, отраженным от поверхности кремния. Помехи количественно оцениваются по разности фаз. $\Phi _{in}$ предоставлено
$\Phi _{in}={\frac {4\pi n_{1}d\cos \theta _{1}^{in}}{\lambda _{ex}}}$
$\theta _{1}^{in}$ — угол падающего света относительно нормали к плоскости кремния. Помехи не только модулируют $F_{in}$, но поверхность кремния не идеально отражает падающий свет. Коэффициенты Френеля дают изменение амплитуды падающей и отраженной волны. Коэффициенты Френеля зависят от углов падения, $\theta _{i}$ и $\theta _{j}$, показатели преломления двух сред и направление поляризации . Углы $\theta _{i}$ и $\theta _{j}$ могут быть связаны по закону Снеллиуса . Выражения для коэффициентов отражения:
$r_{ij}^{TE}={\frac {n_{i}\cos \theta _{i}-n_{j}\cos \theta _{j}}{n_{i}\cos \theta _{i}+n_{j}\cos \theta _{j}}}\quad r_{ij}^{TM}={\frac {n_{j}\cos \theta _{i}-n_{i}\cos \theta _{j}}{n_{j}\cos \theta _{i}+n_{i}\cos \theta _{j}}}$
TE относится к компоненту электрического поля, перпендикулярному плоскости падения, а TM к параллельному компоненту (плоскость падения определяется нормалью к плоскости и направлением распространения света). В декартовых координатах локальное электрическое поле равно
$F_{in}=\sin \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}0\\1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\\0\end{array}}\right]+\cos \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}\cos \theta _{1}^{in}(1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\\0\\\sin \theta _{1}^{in}(1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\end{array}}\right]$
$\gamma _{in}$ — угол поляризации падающего света относительно плоскости падения. Ориентация диполя возбуждения зависит от его угла $\theta _{ex}$ к нормальному и $\phi _{ex}$ азимутально плоскости падения.
${\textit {e}}_{ex}=\left[{\begin{array}{c}\cos \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\sin \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\cos \theta _{ex}\end{array}}\right]$
Два приведенных выше уравнения для $F_{in}$ и ${\textit {e}}_{ex}$ можно объединить, чтобы получить вероятность возбуждения флуорофора в единицу времени $P_{ex}$.
Многие из параметров, использованных выше, в обычном эксперименте будут различаться. В это теоретическое описание следует включить изменение пяти следующих параметров.

• Когерентность возбуждающего света
• Угол падения ( $\theta _{1}^{in}$) возбуждающего света
• Угол поляризации ( $\gamma _{in}$) света возбуждения
• Угол перехода диполя ( $\theta _{ex}$) флуорофора
• Длина волны возбуждающего света ( $\lambda _{ex}$)

Квадратная проекция $\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}$ необходимо усреднить по этим величинам, чтобы получить вероятность возбуждения $P_{ex}$. Усреднение по первым 4 параметрам дает
$<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>\propto \int \sin \theta _{1}^{in}d\theta _{1}^{in}A_{in}(\theta _{1}^{in})\times \int \sin \theta _{ex}d\theta _{ex}O(\theta _{ex})U_{ex}(\lambda _{in},\theta _{1}^{in}.\theta _{ex})$ $U_{ex}=\sin ^{2}\theta _{ex}\mid 1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+\sin ^{2}\theta _{ex}\cos ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+2\cos ^{2}\theta _{ex}\sin ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}$

Пример графика интенсивности FLIC, показывающего относительную интенсивность флуоресценции, измеренную в зависимости от расстояния флуорофора от отражающей поверхности. На реальном экспериментальном графике пики могут быть разной высоты.

Коэффициенты нормализации не учитываются. $O(\theta _{ex})$ – распределение угла ориентации диполей флуорофора. Азимутальный ​ угол $\phi _{ex}$ и угол поляризации $\gamma _{in}$ интегрируются аналитически, поэтому они больше не появляются в приведенном выше уравнении. Чтобы окончательно получить вероятность возбуждения в единицу времени, приведенное выше уравнение интегрируется по разбросу длины волны возбуждения с учетом интенсивности $I(\lambda _{ex})$ и коэффициент экстинкции флуорофора $\epsilon (\lambda _{ex})$.
$P_{ex}\propto \int d\lambda _{ex}I(\lambda _{ex})\epsilon (\lambda _{ex})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>$
Этапы расчета $P_{em}$ эквивалентны приведенным выше при расчете $P_{ex}$ за исключением того, что метки параметров em заменяются на ex , а in — на out .
$P_{em}\propto \int d\lambda _{em}\Phi _{det}(\lambda _{em}){\textit {f}}(\lambda _{em})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>$
Результирующая измеренная интенсивность флуоресценции пропорциональна произведению вероятности возбуждения и вероятности испускания.

$I_{FLIC}\propto P_{ex}P_{em}$
Важно отметить, что эта теория определяет соотношение пропорциональности между измеренной интенсивностью флуоресценции $I_{FLIC}$ и расстояние флуорофора над отражающей поверхностью. Тот факт, что это не соотношение равенства, окажет существенное влияние на процедуру эксперимента.

Экспериментальная установка

Кремниевая пластина обычно используется в качестве отражающей поверхности в эксперименте FLIC. прокладка . Затем поверх кремниевой пластины термически выращивают оксидный слой, который действует как Поверх оксида помещают флуоресцентно меченный образец, например, липидную мембрану, клетку или мембраносвязанные белки. После создания системы отбора проб все, что необходимо, — это эпифлуоресцентный микроскоп и ПЗС- камера для количественных измерений интенсивности.

Это схема экспериментальной установки FLIC с кремнием, тремя оксидными слоями и флуоресцентно меченным липидным бислоем (желтые звезды представляют собой флуорофоры.

Толщина диоксида кремния очень важна для проведения точных измерений FLIC. Как упоминалось ранее, теоретическая модель описывает относительную интенсивность флуоресценции, измеренную в зависимости от высоты флуорофора. Положение флуорофора нельзя просто определить по одной измеренной кривой FLIC. Основная процедура заключается в изготовлении оксидного слоя по меньшей мере двух известных толщин (слой может быть изготовлен с помощью фотолитографических методов, а толщина может быть измерена эллипсометрией ). Используемая толщина зависит от измеряемого образца. Для образца с высотой флуорофора в диапазоне 10 нм оптимальным будет толщина оксида около 50 нм, поскольку кривая интенсивности FLIC здесь самая крутая и будет давать наибольший контраст между высотами флуорофоров. Толщина оксида выше нескольких сотен нанометров может быть проблематичной, поскольку кривая начинает размазываться под воздействием полихроматического света и диапазона углов падения. Соотношение измеренных интенсивностей флуоресценции при различной толщине оксида сравнивается с предсказанным соотношением для расчета высоты флуорофора над оксидом ( $d_{\textit {f}},$).
${\frac {I_{theory}(d_{1})}{I_{theory}(d_{0})}}={\frac {I_{exp}(d_{1}+d_{\textit {f}})}{I_{exp}(d_{0}+d_{\textit {f}})}}$
Затем приведенное выше уравнение можно решить численно, чтобы найти $d_{\textit {f}}$. Несовершенства эксперимента, такие как несовершенное отражение, ненормальное падение света и полихроматический свет, имеют тенденцию размывать резкие кривые флуоресценции. Разброс угла падения можно контролировать с помощью числовой апертуры (NA). Однако, в зависимости от используемой числовой апертуры, эксперимент даст хорошее поперечное разрешение (xy) или хорошее вертикальное разрешение (z), но не то и другое одновременно. Высокая числовая апертура (~1,0) дает хорошее латеральное разрешение, что лучше всего подходит, если целью является определение топографии на больших расстояниях. С другой стороны, низкая числовая апертура (~0,001) обеспечивает точное измерение z-высоты для определения высоты флуоресцентно-меченой молекулы в системе.

Анализ

Пример экспериментальных данных, собранных для флуоресцентно меченного образца толщиной более 16 оксидов. Подгонка кривой к 16 точкам данных даст высоту флуорофоров над поверхностью оксида.

Базовый анализ включает в себя сопоставление данных интенсивности с теоретической моделью, учитывающей расстояние флуорофора над поверхностью оксида ( $d_{\textit {f}}$) быть свободным параметром. Кривые FLIC смещаются влево по мере увеличения расстояния флуорофора над оксидом. $d_{\textit {f}}$ обычно представляет интерес, но для оптимизации подгонки часто включаются несколько других свободных параметров. Обычно включаются амплитудный коэффициент (а) и постоянный аддитивный член для фона (b). Коэффициент амплитуды масштабирует относительную интенсивность модели, а постоянный фон сдвигает кривую вверх или вниз, чтобы учесть флуоресценцию, исходящую из областей, находящихся вне фокуса, например, из верхней части клетки. Иногда числовая апертура (NA) микроскопа может быть свободным параметром настройки. Другие параметры, входящие в оптическую теорию, такие как различные показатели преломления, толщины слоев и длины волн света, считаются постоянными с некоторой неопределенностью. Чип FLIC может быть изготовлен с оксидными террасами разной высоты по 9 или 16, расположенными в блоках. После получения флуоресцентного изображения каждый блок террас 9 или 16 дает отдельную кривую FLIC, которая определяет уникальную $d_{\textit {f}}$. Средний $d_{\textit {f}}$ находится путем компиляции всех $d_{\textit {f}}$ значения в гистограмму.
Статистическая ошибка при расчете $d_{\textit {f}}$ происходит из двух источников: ошибки в подгонке оптической теории к данным и неопределенности толщины оксидного слоя. Систематическая ошибка возникает из трех источников: измерения толщины оксида (обычно эллипсометром), измерения интенсивности флуоресценции с помощью ПЗС-матрицы и неопределенности параметров, используемых в оптической теории. Систематическая ошибка оценивается как $\sim 1nm$.

Ссылки

• Аджо-Франклин, Кэролайн М.; Ёсина-Исии, Чиаки; Боксер, Стивен Г. (2005). «Исследование структуры поддерживаемых мембран и связанных олигонуклеотидов с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Ленгмюр . 21 (11). Американское химическое общество (ACS): 4976–4983. дои : 10.1021/la0468388 . ISSN   0743-7463 . ПМИД   15896039 .
• Браун, Д.; Фромхерц, П. (1 октября 1997 г.). «Флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия клеточной адгезии на окисленном кремнии». Прикладная физика A: Материаловедение и обработка . 65 (4–5). ООО «Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа»: 341–348. Бибкод : 1997ApPhA..65..341B . дои : 10.1007/s003390050589 . ISSN   0947-8396 . S2CID   16478620 .
• Браун, Дитер; Фромхерц, Питер (7 декабря 1998 г.). «Флуоресцентная интерферометрия адгезии нейрональных клеток на микроструктурированном кремнии». Письма о физических отзывах . 81 (23). Американское физическое общество (APS): 5241–5244. Бибкод : 1998PhRvL..81.5241B . дои : 10.1103/physrevlett.81.5241 . ISSN   0031-9007 .
• Крейн, Джонатан М.; Кисслинг, Волкер; Тамм, Лукас К. (2005). «Измерение липидной асимметрии в плоских поддерживаемых бислоях с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Ленгмюр . 21 (4). Американское химическое общество (ACS): 1377–1388. дои : 10.1021/la047654w . ISSN   0743-7463 . ПМИД   15697284 .
• Кайдзука, Ёсихиса; Гровс, Джей Т. (20 марта 2006 г.). «Гидродинамическое демпфирование тепловых колебаний мембраны вблизи поверхностей, полученных с помощью флуоресцентной интерференционной микроскопии». Письма о физических отзывах . 96 (11). Американское физическое общество (APS): 118101. Бибкод : 2006PhRvL..96k8101K . дои : 10.1103/physrevlett.96.118101 . ISSN   0031-9007 . ПМИД   16605875 .
• Кисслинг, Волкер; Тамм, Лукас К. (2003). «Измерение расстояний в поддерживаемых бислоях с помощью флуоресцентной интерференционно-контрастной микроскопии: полимерные подложки и белки SNARE» . Биофизический журнал . 84 (1). Эльзевир Б.В.: 408–418. Бибкод : 2003BpJ....84..408K . дои : 10.1016/s0006-3495(03)74861-9 . ISSN   0006-3495 . ПМК   1302622 . ПМИД   12524294 .
• Ламбахер, Армин; Фромхерц, Питер (1996). «Флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия на окисленном кремнии с использованием слоя мономолекулярного красителя». Прикладная физика A: Материаловедение и обработка . 63 (3). ООО «Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа»: 207–216. Бибкод : 1996ApPhA..63..207L . дои : 10.1007/bf01567871 . ISSN   0947-8396 . S2CID   16072847 .
• Ламбахер, Армин; Фромхерц, Питер (1 июня 2002 г.). «Люминесценция молекул красителей на окисленном кремнии и флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия биомембран». Журнал Оптического общества Америки Б. 19 (6). Оптическое общество: 1435–1453. Бибкод : 2002JOSAB..19.1435L . дои : 10.1364/josab.19.001435 . ISSN   0740-3224 .
• Партасарати, Рагхувир ; Гроувс, Джей Т. (2004). «Оптические методы визуализации топографии мембран». Клеточная биохимия и биофизика . 41 (3). ООО «Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа»: 391–414. дои : 10.1385/cbb:41:3:391 . ISSN   1085-9195 . ПМИД   15509889 . S2CID   11674192 .