Спин-маркировка, ориентированная на сайт
Сайт-направленное спиновое мечение (SDSL) — это метод исследования структуры и локальной динамики белков с использованием электронного спинового резонанса . Теория SDSL основана на специфической реакции спиновых меток с аминокислотами . Встроенную белковую структуру спиновой метки можно обнаружить с помощью ЭПР- спектроскопии. SDSL также является полезным инструментом для изучения процесса сворачивания белков . [1]
Спиновая маркировка
[ редактировать ]
Сайт-направленное спиновое мечение (SDSL) было впервые использовано в лаборатории доктора У. Л. Хаббелла . [2] [3] В SDSL сайты прикрепления спиновых меток вводятся в рекомбинантно экспрессируемые белки посредством сайт-направленного мутагенеза . Функциональные группы, содержащиеся в спин-метке, определяют их специфичность. При нейтральном pH тиоловые группы белка специфически реагируют с функциональными группами метантиосульфонатом, малеимидом и йодацетамидом, создавая ковалентную связь с аминокислотой Cys . [4] Спиновые метки являются уникальными молекулярными репортерами, поскольку они парамагнитны (содержат неспаренный электрон). Спиновые метки были впервые синтезированы в лаборатории Х. М. МакКоннелла в 1965 году. [5] С тех пор различные нитроксидные спиновые метки получили широкое применение для изучения структуры и динамики макромолекул из-за их стабильности и простого сигнала ЭПР . Нитроксильный радикал (NO) обычно включен в гетероциклическое кольцо (например, пирролидиновое ), а неспаренный электрон преимущественно локализован на связи NO. После включения в белок движения спиновой метки определяются ее локальным окружением. Поскольку спиновые метки чрезвычайно чувствительны к движению, это оказывает глубокое влияние на их ЭПР-спектр. [4] [6]
Сборка многосубъединичных мембранных белковых комплексов также изучалась с использованием спин-мечения. Связывание субъединицы PsaC с субъединицами PsaA и PsaB фотосинтетического реакционного центра Фотосистемы I было очень подробно проанализировано с использованием этого метода. [7]
Группа доктора Ральфа Лангена показала, что SDSL с EPR (Университет Южной Калифорнии, Лос-Анджелес) можно использовать для понимания структуры амилоидных фибрилл и структуры мембраносвязанного белка альфа-синуклеина болезни Паркинсона. [8] Исследование 2012 года позволило получить структуру фибрилл IAPP с высоким разрешением с использованием комбинации SDSL, импульсной ЭПР и вычислительной биологии. [9]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ода, Майкл Н. (2003). «С-концевой домен аполипопротеина AI содержит чувствительный к липидам конформационный триггер». Структурная и молекулярная биология природы . 10 (6): 455–60. дои : 10.1038/nsb931 . ПМИД 12754494 . S2CID 25438936 .
- ^ Альтенбах, К.; Флич, СЛ; Корана, Х.Г.; Хаббелл, WL (1989). «Структурные исследования трансмембранных белков. 2. Спиновое мечение мутантов бактериородопсина по уникальным цистеинам». Биохимия . 28 (19): 7806–7812. дои : 10.1021/bi00445a042 . ПМИД 2558712 .
- ^ Альтенбах, К.; Марти, Т.; Корана, Х.Г.; Хаббелл, WL (1990). «Трансмембранная структура белка: спиновая маркировка мутантов бактериородопсина». Наука . 248 (4959): 1088–192. Бибкод : 1990Sci...248.1088A . дои : 10.1126/science.2160734 . ПМИД 2160734 .
- ^ Перейти обратно: а б Клэр, JP; Штайнхофф, Х.-Й. (2009). «ЭПР спиновой маркировки». Исследования фотосинтеза . 102 (2–3): 377–390. дои : 10.1007/s11120-009-9490-7 . ПМИД 19728138 . S2CID 40673871 .
- ^ Стоун, Ти Джей; Бакман, Т.; Нордио, Польша; МакКоннелл, HM (1965). «Спин-меченные биомолекулы» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 54 (4): 1010–1017. Бибкод : 1965ПНАС...54.1010С . дои : 10.1073/pnas.54.4.1010 . ПМК 219782 . ПМИД 5219813 .
- ^ Бординьон, Э .; Штайнхофф, Х.-Й. (2007). «Структура и динамика мембранных белков, изученная с помощью сайт-направленного спинового мечения ESR». Биологическая магнитно-резонансная 27-ЭПР-спектроскопия в мембранной биофизике . Биологический магнитный резонанс. 27 : 129–164. дои : 10.1007/978-0-387-49367-1_5 . ISBN 978-0-387-25066-3 .
- ^ Джаганнатан, Б; Декат, С; Гольбек, Дж. Х.; Лакшми, К.В. (2010). «Сборка многосубъединичного фотосинтетического мембранного белкового комплекса: ЭПР-спектроскопическое исследование субъединицы PsaC в фотосистеме I с сайт-специфической спиновой маркировкой». Биохимия . 49 (11): 2398–2408. дои : 10.1021/bi901483f . ПМИД 20158221 .
- ^ Чен, М.; Маргиттай, М.; Чен, Дж.; Ланген, Р. (2007). «Исследование структуры фибрилл альфа-синуклеина с помощью сайт-направленной спиновой маркировки» . Ж. Биол. Хим . 282 (34): 24970–24979. дои : 10.1074/jbc.M700368200 . ПМИД 17573347 .
- ^ Бедруд, Сахар; Юй Ли; Х. Марио Исас; Балачандра Г. Хегде; Ульрих Бакса; Ян С. Хаворт; Ральф Ланген (февраль 2012 г.). «Фибрильная структура островкового амилоидного полипептида человека» . Ж. Биол. Химия 287 (8): 5235–41. дои : 10.1074/jbc.M111.327817 . ПМЦ 3285303 . ПМИД 22187437 .