Анализ защиты нуклеазы

Анализ нуклеазной защиты — это лабораторный метод, используемый в биохимии и генетике для идентификации отдельных молекул РНК в гетерогенном образце РНК, извлеченном из клеток . Этот метод позволяет идентифицировать одну или несколько молекул РНК известной последовательности даже при низкой общей концентрации . Экстрагированную РНК сначала смешивают с антисмысловыми РНК или ДНК- зондами, которые комплементарны интересующей последовательности или последовательностям, и комплементарные цепи гибридизуют с образованием двухцепочечной РНК (или гибрида ДНК-РНК). Затем смесь подвергают воздействию рибонуклеаз , которые специфически расщепляют только одноцепочечную РНК, но не обладают активностью в отношении двухцепочечной РНК. Когда реакция доходит до завершения, чувствительные участки РНК расщепляются до очень коротких олигомеров или отдельных нуклеотидов ; выжившими фрагментами РНК являются те, которые были комплементарны добавленной антисмысловой цепи и, таким образом, содержали интересующую последовательность.

Зонд

Зонды получают путем клонирования части интересующего гена в векторе под контролем любого из следующих промоторов: SP6, T7 или T3. Эти промоторы распознаются ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, первоначально выделенными из бактериофагов. Полученные зонды радиоактивны, поскольку их получают путем транскрипции in vitro с использованием радиоактивных UTP. Некомплементированная ДНК или РНК отщепляется нуклеазами. Когда зондом является молекула ДНК, нуклеаза S1 используется ; когда зондом является РНК, можно использовать любую одноцепочечную рибонуклеазу. Таким образом, выживший комплемент зонд-мРНК просто выявляется с помощью авторадиографии.

Использование

Анализы нуклеазной защиты используются для картирования интронов и 5'- и 3'- концов транскрибируемых генных областей. Количественные результаты могут быть получены относительно количества целевой РНК, присутствующей в исходном клеточном экстракте — если целью является информационная РНК , это может указывать на уровень транскрипции гена в клетке.

Они также используются для обнаружения присутствия двухцепочечной РНК, наличие которой может означать РНК-интерференцию .

Нозерн-блоттинг — это лабораторный метод, позволяющий получить аналогичную информацию. Он медленнее и менее количественный, но также дает точную информацию о размере целевой РНК. Продукты анализа нуклеазной защиты ограничены размером исходных зондов из-за разрушения негибридизированной РНК во время стадии расщепления нуклеазой.

Ссылки

• Санделин А. и др. Основные промоторы РНК-полимеразы II млекопитающих: результаты полногеномных исследований. Природа преп. Жене. 8, 424–436 (2007)