Циклогексимидная погоня
Анализы циклогексимида — это экспериментальный метод, используемый в молекулярной и клеточной биологии для измерения стабильности белка в устойчивом состоянии . Циклогексимид — это препарат, который ингибирует стадию элонгации трансляции эукариотических белков , тем самым предотвращая синтез белка. [ 1 ] Добавление циклогексимида к культивируемым клеткам с последующим лизисом белка в несколько моментов времени проводится для наблюдения за деградацией белка с течением времени и может использоваться для определения периода полураспада белка. Эти анализы часто сопровождаются вестерн-блоттингом для оценки содержания белка и могут быть проанализированы с использованием количественных инструментов, таких как ImageJ. [ 2 ]
Выполнение
Анализы с использованием циклогексимида проводились с использованием различных типов клеток, таких как линии клеток дрожжей и млекопитающих. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] В зависимости от клеточной системы, используемой для анализа, анализ может различаться по применению и времени. Например, дрожжевые клетки, экспрессирующие интересующий белковый субстрат, обычно требуют воздействия циклогексимида продолжительностью до 90 минут, чтобы обеспечить обмен белка. [ 4 ] [ 7 ] Напротив, белки, которые экспрессируются в клеточных линиях млекопитающих, как правило, более стабильны в устойчивом состоянии и могут потребовать от 3 до 8 часов обработки. [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] В зависимости от сложности белка и того, является ли он сверхэкспрессированным или эндогенным по отношению к модельной системе, требуемая продолжительность поиска может варьироваться. Чтобы гарантировать ингибирование синтеза белка на протяжении всего периода погони, в образец часто каждые несколько часов добавляют циклогексимид.
В дрожжах делеционные штаммы часто используются для оценки стабильности белка с течением времени с помощью циклогексимида. Например, штаммы дрожжей, у которых отсутствуют важные механизмы деградации, такие как шапероны, лигазы Е3 и вакуолярные белки, часто используются для определения механизма деградации интересующего белкового субстрата. [ 5 ] [ 7 ] Медикаментозное лечение (например, MG132 ) также используется для ингибирования стадий деградации с последующим применением циклогексимида, чтобы наблюдать, как это влияет на стабильность интересующего белка. [ 3 ] [ 4 ] [ 7 ] Эти эксперименты можно проводить на клетках млекопитающих с применением совместимых процедур нокдауна вместо штаммов с делецией дрожжей. [ 4 ]
Поиски циклогексимида также полезны для оценки того, как различные мутации влияют на стабильность белка. Эксперименты были проведены на клетках дрожжей и млекопитающих, чтобы определить критические остатки, необходимые для стабильности белка, и то, как мутации, связанные с заболеванием, могут влиять на период полураспада белка внутри клетки. [ 3 ] [ 6 ] Эта информация ценна для понимания сложностей сворачивания белков и того, как мутации способствуют патогенезу заболеваний, с которыми они связаны.
Преимущества
Использование анализов с циклогексимидом имеет множество преимуществ по сравнению с другими методами оценки стабильности белка. Погони за циклогексимидом можно использовать с широким спектром модельных систем и применять для изучения практически любого белкового субстрата. Циклогексимид является относительно недорогим соединением по сравнению с другими препаратами и эффективен при использовании в низких дозах в течение коротких периодов времени. Импульсные анализы являются альтернативой анализам с циклогексимидом и включают в себя радиоактивное мечение вновь транслированных белков с последующим аналогичным периодом «преследования». [ 8 ] Хотя этот метод информативен и позволяет наблюдать за изобилием возникающего белка, радиоактивный материал, который он требует, дорог, имеет более короткий срок хранения и требует большей осторожности при использовании, чем циклогексимид.
Недостатки
Некоторые недостатки проведения анализов по выявлению циклогексимида включают токсичную природу циклогексимида. При использовании в высоких концентрациях в течение длительного периода времени циклогексимид повреждает ДНК внутри клетки и нарушает критически важные клеточные функции. [ 9 ] По этой причине погони за циклогексимидом обычно не длятся более 12 часов. Это представляет собой ограничение, если изучается оборот особенно стабильного белка. Кроме того, отслеживание циклогексимида дает возможность отслеживать только стабильные уровни белков, а не уровни вновь транслируемых белков, например, при импульсном отслеживании. Следовательно, можно наблюдать только деградацию белка, но не его созревание.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Шнайдер-Петч, Тилман; Цзюй, Цзяньхуа; Эйлер, Дэниел Э.; Данг, Юнджун; Бхат, Шридхар; Меррик, Уильям К.; Грин, Рэйчел; Шен, Бен; Лю, Цзюнь О. (2010). «Ингибирование элонгации эукариотической трансляции циклогексимидом и лактимидомицином» . Химическая биология природы . 6 (3): 209–217. дои : 10.1038/nchembio.304 . ПМЦ 2831214 . ПМИД 20118940 .
- ^ Гириш, В.; Виджаялакшми, А. (2004). «Доступный анализ изображений с использованием NIH Image/ImageJ» . Индийский журнал рака . 41 (1): 47. дои : 10.4103/0019-509X.12345 . ПМИД 15105580 . S2CID 44965098 .
- ^ Jump up to: а б с Престон, генеральный менеджер; Геррьеро, CJ; Мецгер, МБ; Михаэлис, С.; Бродский, Ю.Л. (2018). «Нерастворимость субстрата диктует Hsp104-зависимую деградацию, связанную с эндоплазматическим ретикулумом» . Молекулярная клетка . 70 (2): 242–253.e6. doi : 10.1016/j.molcel.2018.03.016 . ПМЦ 5912696 . ПМИД 29677492 .
- ^ Jump up to: а б с д и Ким Чиау, П.; Хантуш, К.; Вонг MJH; Маттес, Э.; Роберт, Р.; Ханрахан, JW; Шриер, А.; Янг, Джей Си (2019). «Hsp70 и DNAJA2 ограничивают уровни CFTR посредством деградации» . ПЛОС ОДИН . 14 (8): e0220984. Бибкод : 2019PLoSO..1420984K . дои : 10.1371/journal.pone.0220984 . ПМК 6692068 . ПМИД 31408507 .
- ^ Jump up to: а б с Нидхэм, П.Г.; Гёкелер-Фрид, Дж.Л.; Чжан, К.; Солнце, З.; Ветцель, Арканзас; Бертран, Калифорния; Бродский, Ю.Л. (2021). «SLC26A9 выбран для деградации, связанной с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD), посредством Hsp70-зависимого нацеливания на растворимый домен STAS» . Биохимический журнал . 478 (24): 4203–4220. дои : 10.1042/BCJ20210644 . ПМЦ 8826537 . ПМИД 34821356 .
- ^ Jump up to: а б с Амико, Г.; Брандас, К.; Моран, О.; Барони, Д. (2019). «Раскрытие областей мутанта F508del-CFTR, более восприимчивых к действию четырех корректоров муковисцидоза» . Международный журнал молекулярных наук . 20 (21): 5463. doi : 10.3390/ijms20215463 . ПМК 6862496 . ПМИД 31683989 .
- ^ Jump up to: а б с Нидхэм, П.Г.; Миколюк, К.; Дхакарвал, П.; Хадем, С.; Снайдер, AC; Субраманья, Арканзас; Бродский, Ю.Л. (2011). «Тиазид-чувствительный котранспортер NaCl нацелен на шаперон-зависимую деградацию, связанную с эндоплазматическим ретикулумом» . Журнал биологической химии . 286 (51): 43611–43621. дои : 10.1074/jbc.M111.288928 . ПМЦ 3243568 . ПМИД 22027832 .
- ^ Солнце, З.; Геррьеро, CJ; Бродский, Ю.Л. (2021). «Субстратный убиквитинирование сохраняет неправильно свернутые мембранные белки в эндоплазматическом ретикулуме для деградации» . Отчеты по ячейкам . 36 (12): 109717. doi : 10.1016/j.celrep.2021.109717 . ПМЦ 8503845 . ПМИД 34551305 .
- ^ Башич-Занинович, Тамара; Папес, Дражена; Франекич, Ясна (1991). «Генотоксичность циклогексимида в тест-системах in vitro и in vivo» . Письма об исследованиях мутаций . 263 (4): 203–210. дои : 10.1016/0165-7992(91)90002-L . ПМИД 1861684 .