Усиленный рестрикционный анализ рибосомальной ДНК

Рестрикционный анализ амплифицированной рДНК (рибосомальной ДНК) представляет собой расширение метода RFLP ( полиморфизма длины рестрикционного фрагмента ) на ген, кодирующий (16s) рибосомальную субъединицу бактерий малую . Этот метод включает ферментативную амплификацию с использованием праймеров, направленных на консервативные области на концах гена 16s, с последующим расщеплением с использованием рестрикционных ферментов тетракаттера . Полученная картина считается репрезентативной для анализируемого вида. Паттерны, полученные от нескольких ферментов рестрикции, можно использовать для филогенетической характеристики культивируемых изолятов и генов 16s, полученных путем клонирования из ДНК сообщества. ^{[ 1 ]}

Обоснование и процедура ARDRA

Ваничаутт и др. , ^{[ 2 ]} были одними из первых, кто использовал этот метод и применил его для характеристики видов Mycobacterium и Acinetobacter. ^{[ 3 ]} Во многих других исследованиях ARDRA применялась для различных таксонов бактерий. Основываясь на простой формуле частоты случайного появления сайта рестрикции, последовательность из 4 пар оснований может встречаться один раз каждые 256 пар оснований. Фермент рестрикции, имеющий сайт узнавания длиной более 4 п.о., не будет иметь значения по отношению к гену длиной примерно 1500 п.о., например, кодирующему субъединицу рибосомы 16s. На рынке доступен ряд ферментов рестрикции тетракаттера. Для обеспечения статистической значимости для анализа необходимо использовать как минимум три фермента рестрикции, чтобы преодолеть вероятность того, что определенные ферменты рестрикции будут давать сходные закономерности для не столь уж неродственных организмов.

Анализируемый ампликон предпочтительно должен иметь размер более 1000 п.о. исключительно ради большей вероятности обнаружения сайта рестрикции. Ампликоны предпочтительно должны быть очищены перед расщеплением. Это можно сделать с помощью многочисленных имеющихся в продаже наборов для очистки. Следует проявлять осторожность при выборе ферментов рестрикции. Некоторые ферменты рестрикции распознают одни и те же сайты и не могут внести продуктивный вклад в анализ. Рекомендуется переваривание в течение ночи (10–16 часов) примерно 300–500 нг ампликонной ДНК в системе объемом 20 мкл с 4–5 единицами рестрикционного фермента вместе с рекомендуемым буфером при предписанной температуре. После расщепления реакцию останавливают и весь расщепляют в 2-3% агарозном геле при 90-100 В. Длина геля должна обеспечивать правильное разделение незначительных фрагментов размером всего 100-200 п.н.

Анализ шаблонов выполняется с помощью методов, используемых для шаблонов RAPD . Кластеры родственных бактерий могут быть представлены в виде кладограммы или филограммы . После первоначального анализа программа многомерного анализа, такая как NT-SYS. ^{[ 4 ]} или ПРОШЛОЕ ^{[ 5 ]} предоставление сведений о наличии или отсутствии полос, отмеченных цифрами 1 (присутствие) и 0 (отсутствие). Данные впоследствии могут быть использованы для создания филограммы или кладограммы . Таблицу данных можно использовать для построения филогенетического дерева, которое будет указывать на родство организмов на основе паттерна ограничения, полученного из их соответствующих генов 16s. Для анализа этих закономерностей также доступно коммерческое программное обеспечение, наиболее часто используются пакеты GelCompar II и BioNumerics .

Ссылки

^ Скларц М., Р. Энджел, О. Гиллор и МИМ. Соарес. 2009. Оценка анализа рестрикции амплифицированной рДНК для идентификации бактериальных сообществ. Ант ван Левенгук 96:659–664.
^ Ваничаутт, М., Х. Де Бенхаувер, Г. Клейс, Г. Вершреген, А. Де Рук, Н. Паепе, А. Элайшуни и Ф. Портаэлс. 1993. Идентификация видов Mycobacterium с помощью усиленного рестрикционного анализа рДНК. Дж. Клин. Микробиол. 31:2061–2065.
^ Ваничаутт, М., Л. Дейксхорн, И. Тьернберг, А. Элайчуни, П. Де вос, Г. Клейс и Г. Вершреген. 1995. Идентификация геномных видов Acinetobacter с помощью амплифицированного рестрикционного анализа рибосомальной ДНК. Дж. Клин. Микробиол. 33:11–15.
^ Программное обеспечение Exeter: NTSYSpc http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html
^ Палеонтологическая статистика: http://folk.uio.no/ohammer/past/

[1] Скларц М., Р. Энджел, О. Гиллор и МИМ. Соарес. 2009. Оценка анализа рестрикции амплифицированной рДНК для идентификации бактериальных сообществ. Ант ван Левенгук 96:659–664.

[2] Ваничаутт, М., Х. Де Бенхаувер, Г. Клейс, Г. Вершреген, А. Де Рук, Н. Паепе, А. Элайшуни и Ф. Портаэлс. 1993. Идентификация видов Mycobacterium с помощью усиленного рестрикционного анализа рДНК. Дж. Клин. Микробиол. 31:2061–2065.

[3] Ваничаутт, М., Л. Дейксхорн, И. Тьернберг, А. Элайчуни, П. Де вос, Г. Клейс и Г. Вершреген. 1995. Идентификация геномных видов Acinetobacter с помощью амплифицированного рестрикционного анализа рибосомальной ДНК. Дж. Клин. Микробиол. 33:11–15.

[4] Программное обеспечение Exeter: NTSYSpc http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html

[5] Палеонтологическая статистика: http://folk.uio.no/ohammer/past/

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]