МТТ-анализ

МТТ -анализ представляет собой колориметрический анализ для оценки метаболической активности клеток. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} НАД(Ф)Н-зависимые ферменты клеточной оксидоредуктазы могут при определенных условиях отражать количество присутствующих жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель МТТ, который химически представляет собой 3-(4,5- диметилтиазол - 2 -ил)-2,5- бромид дифенилтетразолий , до его нерастворимого формазана , имеющего фиолетовый цвет. Другие близкородственные тетразолиевые красители, включая XTT, MTS и WST, используются в сочетании с промежуточным акцептором электронов, 1-метоксифеназинметосульфатом (PMS). В случае WST-1, который непроницаем для клеток, восстановление происходит вне клетки посредством транспорта электронов через плазматическую мембрану. ^{[ 3 ]} Однако это традиционно предполагаемое объяснение в настоящее время оспаривается, поскольку также было обнаружено доказательство восстановления МТТ до формазана в липидных клеточных структурах без явного участия оксидоредуктаз. ^{[ 4 ]}

Анализы с тетразолиевым красителем также можно использовать для измерения цитотоксичности (потеря жизнеспособных клеток) или цитостатической активности (переход от пролиферации к состоянию покоя) потенциальных лекарственных средств и токсичных материалов. Анализы МТТ обычно проводятся в темноте, поскольку реагент МТТ чувствителен к свету. ^{[ 5 ]}^{[ 6 ]}^{[ 7 ]}

МТТ и родственные соли тетразолия

МТТ , желтый тетразол восстанавливается до фиолетового формазана . , в живых клетках ^{[ 8 ]} Раствор для солюбилизации (обычно диметилсульфоксид , подкисленный раствор этанола или раствор детергента додецилсульфата натрия в разбавленной соляной кислоте ) добавляется для растворения нерастворимого фиолетового продукта формазана в окрашенном растворе. Поглощение ( этого окрашенного раствора можно определить количественно путем измерения на определенной длине волны обычно от 500 до 600 нм) с помощью спектрофотометра . Степень поглощения света зависит от степени концентрации формазана, накопленного внутри клетки и на ее поверхности. Чем выше концентрация формазана, тем глубже фиолетовый цвет и, следовательно, выше поглощение.

ХТТ (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилид) был предложен для замены МТТ, что обеспечивает более высокую чувствительность и более широкий динамический диапазон. Образовавшийся формазановый краситель растворим в воде, что позволяет избежать конечной стадии солюбилизации. ^{[ 9 ]}

Водорастворимые соли тетразолия являются более поздней альтернативой МТТ: они были разработаны путем введения положительных или отрицательных зарядов и гидроксильных групп в фенильное кольцо соли тетразолия или, что лучше, с помощью сульфонатных групп, добавленных прямо или косвенно к фенильному кольцу.

МТС (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) в присутствии феназинметосульфата ( ПМС ) образует формазан. продукт, имеющий максимум поглощения при 490 нм в фосфатно-солевом буфере. Анализ MTS часто описывается как «одноэтапный» анализ MTT, который обеспечивает удобство добавления реагента непосредственно в культуру клеток без периодических этапов, необходимых для анализа MTT. Однако это удобство делает анализ MTS чувствительным к колориметрическому вмешательству, поскольку прерывистые этапы анализа MTT удаляют следы окрашенных соединений, в то время как в одноэтапном анализе MTS они остаются на микротитровальном планшете. Необходимы меры предосторожности для обеспечения точности при использовании этого анализа, и существуют веские аргументы в пользу подтверждения результатов MTS с использованием качественных наблюдений под микроскопом. (Однако это целесообразно для всех колориметрических анализов.) ^{[ 10 ]}

WST (водорастворимые соли тетразолия) представляют собой серию других водорастворимых красителей для анализов МТТ, разработанных для получения различных спектров поглощения образующихся формазанов. ^{[ 11 ]} WST-1 и, в частности, WST-8 (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолий) имеют преимущества перед МТТ в что они восстанавливаются вне клеток в сочетании с электронным медиатором PMS и образуют водорастворимый формазан. Наконец, анализы WST (1) можно считывать напрямую (в отличие от МТТ, для которого требуется этап солюбилизации), (2) давать более эффективный сигнал, чем МТТ, и (3) снижать токсичность для клеток (в отличие от проницаемого для клеток МТТ и его нерастворимого формазан, накапливающийся внутри клеток). ^{[ 11 ]}

Значение

Обычно предполагается, что восстановление красителя тетразолия зависит от НАД(Ф)Н-зависимых ферментов оксидоредуктазы, главным образом, в цитозольном компартменте клетки. ^{[ 3 ]}^{[ 12 ]} Следовательно, восстановление МТТ и других тетразолиевых красителей зависит от метаболической активности клеток за счет потока НАД(Ф)Н. Клетки с низким метаболизмом, такие как тимоциты и спленоциты, снижают МТТ очень незначительно. Напротив, быстро делящиеся клетки демонстрируют высокие темпы снижения МТТ. Важно иметь в виду, что условия анализа могут изменить метаболическую активность и, следовательно, уменьшить количество красителя тетразолия, не влияя на жизнеспособность клеток. ^{[ 13 ]} механизмом восстановления тетразолиевых красителей, т.е. внутриклеточным (MTT, MTS) по сравнению с Кроме того, количество продукта также будет определяться внеклеточным (WST-1). Кроме того, были представлены доказательства спонтанного восстановления МТТ в липидных клеточных компартментах/структурах без участия ферментативного катализа. ^{[ 4 ]} Тем не менее, даже в рамках этой альтернативной парадигмы анализ МТТ по-прежнему оценивает восстановительный потенциал клетки (т.е. доступность восстанавливающих соединений для управления клеточной энергетикой). ^{[ 2 ]} Таким образом, окончательная интерпретация жизнеспособности клеток остается неизменной.

При изучении жизнеспособности клеток, высеянных на 3D-волокнистые каркасы, толщина каркасов может влиять на результаты анализа МТТ. ^{[ 14 ]}

Наблюдение

Оптическая плотность (ОП) при 550 нм используется для расчета процента результатов жизнеспособности с использованием следующего уравнения: ^{[ 15 ]}

Жизнеспособность % = 100 × OD550e / OD550b

где:

OD550e = Среднее значение измеренной оптической плотности испытуемого объекта
OD550b = Среднее значение измеренной оптической плотности отрицательного контроля

См. также

Ссылки

^ Гаванджи С., Бахтари А., Фамурева А.С., Отман Э.М. (январь 2023 г.). «Цитотоксическая активность растительных лекарственных средств, оцененная in vitro: обзор» . Химия и биоразнообразие . 20 (2): 3–27. дои : 10.1002/cbdv.202201098 . ПМИД 36595710 . S2CID 255473013 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Стокерт Х.К., Хоробин Р.В., Коломбо Л.Л., Бласкес-Кастро А. (апрель 2018 г.). «Соли тетразолия и продукты формазана в клеточной биологии: оценка жизнеспособности, флуоресцентная визуализация и перспективы маркировки» (PDF) . Акта гистохимика . 120 (3): 159–167. дои : 10.1016/j.acthis.2018.02.005 . ПМИД 29496266 . Архивировано (PDF) из оригинала 24 февраля 2022 г. Проверено 15 апреля 2020 г.
^ Перейти обратно: ^а ^б Берридж М.В., Херст П.М., Тан А.С. (2005). «Тетразолиевые красители как инструменты клеточной биологии: новый взгляд на их клеточное восстановление». Ежегодный обзор биотехнологии . 11 : 127–152. дои : 10.1016/S1387-2656(05)11004-7 . ISBN 9780444519528 . ПМИД 16216776 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Стокерт Х.К., Бласкес-Кастро А., Каньете М., Хоробин Р.В., Вильянуэва А. (декабрь 2012 г.). «МТТ-анализ жизнеспособности клеток: внутриклеточная локализация продукта формазана находится в липидных каплях». Акта гистохимика . 114 (8): 785–796. дои : 10.1016/j.acthis.2012.01.006 . ПМИД 22341561 .
^ Шарма, доктор Рудра (05 октября 2022 г.). «Тест на цитотоксичность с помощью анализа МТТ – процедура, анализ и результаты – ACME Research Solutions» . Проверено 6 октября 2022 г.
^ Мюллер, Г.; Крамер, А. (2006). «Сравнительное исследование цитотоксичности повидон-йода in vitro в растворе, мази или липосомальном составе (Repithel<sup>®</sup>) и отдельных антисептиков» . Дерматология . 212 (Приложение 1): 91–93. дои : 10.1159/000090102 . ISSN 1018-8665 . ПМИД 16490982 . S2CID 818013 .
^ Пинтор, АВБ; Кейруш, LD; Барселос, Р.; Примо, МСУ; Майя, ЖК; Алвес, ГГ (27 июля 2020 г.). «МТТ по сравнению с другими анализами жизнеспособности клеток для оценки биосовместимости материалов для пломбирования корневых каналов: систематический обзор» . Международный эндодонтический журнал . 53 (10): 1348–1373. дои : 10.1111/iej.13353 . ISSN 0143-2885 . ПМИД 32602945 . S2CID 220271896 .
^ Мосманн Т. (декабрь 1983 г.). «Быстрый колориметрический анализ роста и выживания клеток: применение к анализам пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов . 65 (1–2): 55–63. дои : 10.1016/0022-1759(83)90303-4 . ПМИД 6606682 .
^ «Почему мне следует использовать XTT вместо MTT» (PDF, 0,1 МБ) . [aniara.com] . АНИАРА . Архивировано (PDF) из оригинала 06 апреля 2018 г. Проверено 19 ноября 2010 г.
^ Кори А.Х., Оуэн Т.К., Барлтроп Дж.А., Кори Дж.Г. (июль 1991 г.). «Использование водорастворимого теста тетразолий/формазан для анализа роста клеток в культуре». Раковые коммуникации . 3 (7): 207–212. дои : 10.3727/095535491820873191 . ПМИД 1867954 .
^ Перейти обратно: ^а ^б «Водорастворимые соли тетразолия (WST)» (PDF, 0,4 МБ) . [interchim.com] . Интерхим . Архивировано (PDF) из оригинала 22 декабря 2018 г. Проверено 12 августа 2013 г.
^ Берридж М.В., Тан А.С. (июнь 1993 г.). «Характеристика клеточного восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ): субклеточная локализация, зависимость от субстрата и участие митохондриального электронного транспорта в восстановлении МТТ». Архив биохимии и биофизики . 303 (2): 474–482. дои : 10.1006/abbi.1993.1311 . ПМИД 8390225 .
^ Гасеми М., Тернбулл Т., Себастьян С., Кемпсон I (ноябрь 2021 г.). «Анализ МТТ: полезность, ограничения, подводные камни и интерпретация при массовом и одноклеточном анализе» . Международный журнал молекулярных наук . 22 (23): 12827. doi : 10.3390/ijms222312827 . ПМЦ 8657538 . ПМИД 34884632 .
^ Люндуп А.В., Демченко А.Г., Тенчурин Т.Х., Крашенинников М.Е., Клабуков И.Д., Шепелев А.Д. (2016). «Повышение эффективности посева культур стромальных и эпителиальных клеток в биоразлагаемые матрицы путем динамического культивирования». Гены в клетки . 11 (3): 102–107. дои : 10.5281/zenodo.1175840 . ISSN 2313-1829 .
^ «ИСО 10993-5:2009» . ИСО . Проверено 6 октября 2022 г.

Дальнейшее чтение

Уилсон А.П. (2000). «Глава 7: Цитотоксичность и жизнеспособность». В Masters JR (ред.). Культура клеток животных: практический подход . Том. 1 (3-е изд.). Оксфорд: Издательство Оксфордского университета . ISBN 978-0-19-963796-6 . LCCN 00026267 . OCLC 43555390 . Архивировано из оригинала 14 апреля 2020 г. Проверено 24 сентября 2016 г.
Бернас Т., Добруцки Дж. (апрель 2002 г.). «Митохондриальное и немитохондриальное восстановление МТТ: взаимодействие МТТ с митохондриальными флуоресцентными зондами TMRE, JC-1 и NAO» . Цитометрия . 47 (4): 236–242. дои : 10.1002/cyto.10080 . ПМИД 11933013 .

Внешние ссылки

Протокол анализа МТТ

[1] Гаванджи С., Бахтари А., Фамурева А.С., Отман Э.М. (январь 2023 г.). «Цитотоксическая активность растительных лекарственных средств, оцененная in vitro: обзор» . Химия и биоразнообразие . 20 (2): 3–27. дои : 10.1002/cbdv.202201098 . ПМИД 36595710 . S2CID 255473013 .

[Stockert_2018-2] Перейти обратно: ^а ^б Стокерт Х.К., Хоробин Р.В., Коломбо Л.Л., Бласкес-Кастро А. (апрель 2018 г.). «Соли тетразолия и продукты формазана в клеточной биологии: оценка жизнеспособности, флуоресцентная визуализация и перспективы маркировки» (PDF) . Акта гистохимика . 120 (3): 159–167. дои : 10.1016/j.acthis.2018.02.005 . ПМИД 29496266 . Архивировано (PDF) из оригинала 24 февраля 2022 г. Проверено 15 апреля 2020 г.

[Berridge_2005-3] Перейти обратно: ^а ^б Берридж М.В., Херст П.М., Тан А.С. (2005). «Тетразолиевые красители как инструменты клеточной биологии: новый взгляд на их клеточное восстановление». Ежегодный обзор биотехнологии . 11 : 127–152. дои : 10.1016/S1387-2656(05)11004-7 . ISBN 9780444519528 . ПМИД 16216776 .

[Stockert_2012-4] Перейти обратно: ^а ^б Стокерт Х.К., Бласкес-Кастро А., Каньете М., Хоробин Р.В., Вильянуэва А. (декабрь 2012 г.). «МТТ-анализ жизнеспособности клеток: внутриклеточная локализация продукта формазана находится в липидных каплях». Акта гистохимика . 114 (8): 785–796. дои : 10.1016/j.acthis.2012.01.006 . ПМИД 22341561 .

[5] Шарма, доктор Рудра (05 октября 2022 г.). «Тест на цитотоксичность с помощью анализа МТТ – процедура, анализ и результаты – ACME Research Solutions» . Проверено 6 октября 2022 г.

[6] Мюллер, Г.; Крамер, А. (2006). «Сравнительное исследование цитотоксичности повидон-йода in vitro в растворе, мази или липосомальном составе (Repithel<sup>®</sup>) и отдельных антисептиков» . Дерматология . 212 (Приложение 1): 91–93. дои : 10.1159/000090102 . ISSN 1018-8665 . ПМИД 16490982 . S2CID 818013 .

[7] Пинтор, АВБ; Кейруш, LD; Барселос, Р.; Примо, МСУ; Майя, ЖК; Алвес, ГГ (27 июля 2020 г.). «МТТ по сравнению с другими анализами жизнеспособности клеток для оценки биосовместимости материалов для пломбирования корневых каналов: систематический обзор» . Международный эндодонтический журнал . 53 (10): 1348–1373. дои : 10.1111/iej.13353 . ISSN 0143-2885 . ПМИД 32602945 . S2CID 220271896 .

[pmid6606682-8] Мосманн Т. (декабрь 1983 г.). «Быстрый колориметрический анализ роста и выживания клеток: применение к анализам пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов . 65 (1–2): 55–63. дои : 10.1016/0022-1759(83)90303-4 . ПМИД 6606682 .

[9] «Почему мне следует использовать XTT вместо MTT» (PDF, 0,1 МБ) . [aniara.com] . АНИАРА . Архивировано (PDF) из оригинала 06 апреля 2018 г. Проверено 19 ноября 2010 г.

[pmid1867954-10] Кори А.Х., Оуэн Т.К., Барлтроп Дж.А., Кори Дж.Г. (июль 1991 г.). «Использование водорастворимого теста тетразолий/формазан для анализа роста клеток в культуре». Раковые коммуникации . 3 (7): 207–212. дои : 10.3727/095535491820873191 . ПМИД 1867954 .

[WSTs-11] Перейти обратно: ^а ^б «Водорастворимые соли тетразолия (WST)» (PDF, 0,4 МБ) . [interchim.com] . Интерхим . Архивировано (PDF) из оригинала 22 декабря 2018 г. Проверено 12 августа 2013 г.

[pmid-12] Берридж М.В., Тан А.С. (июнь 1993 г.). «Характеристика клеточного восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ): субклеточная локализация, зависимость от субстрата и участие митохондриального электронного транспорта в восстановлении МТТ». Архив биохимии и биофизики . 303 (2): 474–482. дои : 10.1006/abbi.1993.1311 . ПМИД 8390225 .

[13] Гасеми М., Тернбулл Т., Себастьян С., Кемпсон I (ноябрь 2021 г.). «Анализ МТТ: полезность, ограничения, подводные камни и интерпретация при массовом и одноклеточном анализе» . Международный журнал молекулярных наук . 22 (23): 12827. doi : 10.3390/ijms222312827 . ПМЦ 8657538 . ПМИД 34884632 .

[14] Люндуп А.В., Демченко А.Г., Тенчурин Т.Х., Крашенинников М.Е., Клабуков И.Д., Шепелев А.Д. (2016). «Повышение эффективности посева культур стромальных и эпителиальных клеток в биоразлагаемые матрицы путем динамического культивирования». Гены в клетки . 11 (3): 102–107. дои : 10.5281/zenodo.1175840 . ISSN 2313-1829 .

[15] «ИСО 10993-5:2009» . ИСО . Проверено 6 октября 2022 г.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]