МАГЕСТИК

Мультиплексное точное редактирование генома с помощью коротких, отслеживаемых, интегрированных сотовых штрих-кодов ( MAGESTIC ) — это платформа, основанная на технологии CRISPR /Cas. Он еще больше улучшает CRISPR/Cas, делая процесс редактирования генов более точным. Это также увеличивает выживаемость клеток в процессе редактирования до семи раз.

Эта технология была изобретена в Стэнфордском центре геномных технологий в сотрудничестве с Объединенной инициативой по метрологии в биологии (JIMB). которая представляет собой коалицию Стэнфордского университета и Национального института стандартов и технологий .

Обзор

Редактирование генов используется для решения различных задач, включая изменение сельскохозяйственных культур, изменение бактерий и изменение вызывающих заболевания генетических мутаций у пациентов . Когда требуется только одна отредактированная клеточная линия, CRISPR/Cas в сочетании с эффективностью репарации эндогенной ДНК достаточно для получения отредактированной клеточной линии. Однако при попытке внести в мультиплекс множество изменений более высокая эффективность направленного восстановления по гомологии требуется . Технология MAGESTIC состоит из нескольких компонентов. Один из компонентов, белок LexA-Fkh1, участвует в процессе привлечения доноров, что повышает эффективность репарации, направленной на гомологию. Второй компонент представляет собой библиотеку направляющих РНК CRISPR в паре с донорской ДНК, которая кодирует указанные изменения для интеграции посредством репарации, направленной на гомологию. Это, в свою очередь, связано со штрих-кодами ДНК , которые позволяют отслеживать определенные варианты в пулах, аналогично тому, как работают полногеномные экраны нокаута CRISPR-Cas9 , только MAGESTIC более универсален, поскольку он допускает не только потерю редактирования функций, но и также Изменения кодонов ДНК , однонуклеотидный полиморфизм , индели и другие типы генетических изменений, которые необходимо вводить и отслеживать. Повышая эффективность репарации ДНК, используя синтезированные в массиве направляющие-донорные олигонуклеотиды для высокопроизводительного редактирования на основе плазмид и интегрируя геномный штрих-код для предотвращения потери плазмидного штрих-кода, MAGESTIC приводит к созданию более однородных пулов с интегрированными в геном стабильными единичными копиями штрих-кодов и позволяет устойчивое фенотипирование.

Привлечение доноров

Поскольку на редактирование нескольких сайтов в пулах может влиять ряд факторов, включая неэффективную направляющую РНК CRISPR , ошибки синтеза ДНК , конкуренцию с негомологичным соединением концов и другие проблемы, возникающие при создании мультиплексных библиотек, для скрининга MAGESTIC требовалось улучшенное восстановление ДНК. Именно здесь вступает в игру аспект MAGESTIC по привлечению доноров. MAGESTIC достигает большей эффективности редактирования за счет локализации донорской ДНК в местах разрывов ДНК, возникших в результате разреза CRISPR.

Аппарат CRISPR разрезает геном в нужных местах, а затем MAGESTIC направляет донорскую ДНК к месту этого разреза, чтобы направить клетки на внесение запланированных изменений в участки разреза ДНК. Эта технология называется рекрутингом доноров и основана на слитом белке, который содержит один домен, рекрутируемый на разрывы ДНК, и другой домен, который связывается с ДНК донора. Это позволяет создавать высококачественные пулы точного редактирования в дрожжах, где каждая клетка содержит одно редактирование и штрих-код ДНК. Аспект этой технологии, связанный с привлечением доноров, также потенциально может повысить эффективность редактирования дополнительных типов клеток, таких как клетки млекопитающих. Однажды это может оказаться полезным для генной терапии или другого терапевтического редактирования.