НАСБА (молекулярная биология)

Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот, обычно называемая NASBA , представляет собой метод молекулярной биологии , который используется для получения множества копий одноцепочечной РНК. ^{[ 1 ]} NASBA — это двухэтапный процесс, в ходе которого РНК отжигается специально разработанными праймерами, а затем для ее амплификации используется коктейль ферментов. ^{[ 2 ]}

Фон

Амплификация нуклеиновых кислот — это метод, используемый для создания нескольких копий определенного сегмента РНК/ДНК. ^{[ 3 ]} Амплифицированные РНК и ДНК можно использовать для различных целей, таких как генотипирование, секвенирование и обнаружение бактерий или вирусов. ^{[ 4 ]} Существует два разных типа амплификации: неизотермическая и изотермическая. ^{[ 5 ]} Неизотермическая амплификация производит несколько копий РНК/ДНК посредством повторяющегося циклического изменения температуры. ^{[ 6 ]} Изотермическая амплификация производит несколько копий РНК/ДНК при постоянной температуре реакции. ^{[ 7 ]} NASBA берет одноцепочечную РНК, отжигает к ней праймеры при 65°C, а затем амплифицирует ее при 41°C для получения множества копий одноцепочечной РНК. ^{[ 8 ]} Для успешной амплификации используется коктейль ферментов, содержащий обратную транскриптазу птичьего миелобластоза (AMV-RT), РНКазу H и РНК-полимеразу. ^{[ 9 ]} AMV-RT синтезирует комплементарную цепь ДНК (кДНК) из матрицы РНК после отжига праймера. ^{[ 10 ]} Затем РНКаза H разрушает матрицу РНК, а другой праймер связывается с кДНК с образованием двухцепочечной ДНК, которую РНК-полимераза использует для синтеза копий РНК. ^{[ 11 ]} Одним из ключевых аспектов NASBA является то, что исходным материалом и конечным продуктом всегда является одноцепочечная РНК. При этом его можно использовать для амплификации ДНК, но для успешной амплификации ДНК должна быть транслирована в РНК.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) — еще один метод изотермической амплификации.

История

NASBA была разработана Дж. Комптоном в 1991 году, который определил ее как «зависимую от праймера технологию, которую можно использовать для непрерывной амплификации нуклеиновых кислот в одной смеси при одной температуре». ^{[ 12 ]} Сразу после изобретения НАСБА его использовали для быстрой диагностики и количественного определения ВИЧ-1 в сыворотке пациентов. ^{[ 13 ]} Хотя РНК также можно амплифицировать с помощью ПЦР с использованием обратной транскриптазы (чтобы синтезировать комплементарную цепь ДНК в качестве матрицы), основное преимущество NASBA заключается в том, что она работает в изотермических условиях – обычно при постоянной температуре 41 °C или двух разных температурах. , в зависимости от используемых праймеров и ферментов. Даже когда применяются две разные температуры, они все равно считаются изотермическими, поскольку между этими температурами не происходит циклического изменения. NASBA может использоваться в медицинской диагностике как альтернатива ПЦР, которая в некоторых случаях является более быстрой и чувствительной. ^{[ 14 ]}

Процедура

Вкратце, NASBA работает следующим образом:

В реакционную смесь добавляют матрицу РНК, первый праймер с промоторной областью Т7 на 5'-конце прикрепляется к комплементарному участку на 3'-конце матрицы.
Обратная транскриптаза синтезирует противоположную комплементарную цепь ДНК, удлиняя 3'-конец праймера, продвигаясь вверх по матрице РНК.
РНКаза H разрушает матрицу РНК из соединения ДНК-РНК (РНКаза H разрушает только РНК в гибридах РНК-ДНК, но не одноцепочечную РНК).
Второй праймер прикрепляется к 5'-концу (антисмысловой) цепи ДНК.
Обратная транскриптаза снова синтезирует другую цепь ДНК из прикрепленного праймера, в результате чего образуется двухцепочечная ДНК.
РНК-полимераза Т7 связывается с промоторной областью двойной цепи. Поскольку РНК-полимераза Т7 может транскрибироваться только в направлении от 3’ к 5’ ^{[ 15 ]} смысловая ДНК транскрибируется и образуется антисмысловая РНК. Это повторяется, и полимераза непрерывно производит комплементарные цепи РНК этой матрицы, что приводит к амплификации.
Теперь может начаться циклическая фаза, аналогичная предыдущим шагам. Однако здесь второй праймер сначала связывается с (-)РНК.
Обратная транскриптаза теперь образует дуплекс (+)кДНК/(-)РНК.
РНКаза H снова разрушает РНК, и первый праймер связывается с теперь уже одноцепочечной +(кДНК).
Обратная транскриптаза теперь производит комплементарную (-) ДНК, создавая дуплекс дцДНК.
Точно так же, как и на этапе 6, полимераза Т7 связывается с промоторной областью, образуя (-)РНК, и цикл завершается.

Клинические применения

Метод NASBA использовался для разработки экспресс-диагностических тестов для нескольких патогенных вирусов с геномами одноцепочечной РНК, например гриппа А, ^{[ 16 ]} вирус Зика, ящура , вирус ^{[ 17 ]} , связанный с тяжелым острым респираторным синдромом ( ТОРС ) коронавирус , ^{[ 18 ]} бокавирус человека (HBoV) ^{[ 19 ]} а также паразиты, такие как Trypanosoma brucei . ^{[ 20 ]}

Недавно для диагностики COVID-19 была разработана реакция NASBA с флюоресценцией, измерительной полоской и считыванием секвенирования нового поколения. ^{[ 21 ]}

См. также

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Ссылки

^ Дейман, Биргит; ван Арле, Пьер; Силлекенс, Питер (2002). «Характеристики и применение амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA)» . Молекулярная биотехнология . 20 (2): 163–180. дои : 10.1385/мб:20:2:163 . ISSN 1073-6085 . ПМИД 11876473 . S2CID 28712952 .
^ Рид, Адам Дж.; Коннелли, Райан П.; Уильямс, Эллисон; Тран, Майти; Шим, Бён-Шик; Чхве, Хёрён; Герасимова Юлия В. (март 2019 г.). «Безметочное обнаружение патогенов с помощью дезоксирибозимного каскада с визуальным считыванием сигнала» . Датчики и исполнительные механизмы B: Химические вещества . 282 : 945–951. дои : 10.1016/j.snb.2018.11.147 . ISSN 0925-4005 . ПМК 6713451 . ПМИД 31462856 .
^ Лэмб, Лаура Э.; Бартолоне, Сара Н.; Дерево, Майя О.; Конвей, Майкл Дж.; Россиньоль, Жюльен; Смит, Кристофер П.; Канцлер Майкл Б. (декабрь 2018 г.). «Быстрое обнаружение вируса Зика в образцах мочи и инфицированных комарах с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией» . Научные отчеты . 8 (1): 3803. Бибкод : 2018NatSR...8.3803L . дои : 10.1038/s41598-018-22102-5 . ISSN 2045-2322 . ПМЦ 5830622 . ПМИД 29491389 .
^ Шахтер, Юлиус (1997), «Оценка диагностических тестов — особые проблемы, возникающие при процедурах амплификации ДНК» , «Применение технологий амплификации нуклеиновых кислот для диагностики заболеваний » , Бостон, Массачусетс: Birkhäuser Boston, стр. 165–169, doi : 10.1007/978- 1-4612-2454-9_12 , ISBN 978-1-4612-7543-5 , получено 15 ноября 2020 г.
^ Биолаборатории, Новая Англия. «Изотермическое усиление | НЭБ» . www.neb.com . Проверено 15 ноября 2020 г.
^ Биолаборатории, Новая Англия. «Изотермическое усиление | НЭБ» . www.neb.com . Проверено 15 ноября 2020 г.
^ Биолаборатории, Новая Англия. «Изотермическое усиление | НЭБ» . www.neb.com . Проверено 15 ноября 2020 г.
^ Малек, Л.; Сукнанан, Р.; Комптон, Дж. (1994). Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) . Методы молекулярной биологии. Том. 28. стр. 253–260. дои : 10.1385/0-89603-254-x:253 . ISSN 1064-3745 . ПМИД 7509695 . S2CID 30720773 .
^ Малек, Л.; Сукнанан, Р.; Комптон, Дж. (1994). Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) . Методы молекулярной биологии. Том. 28. стр. 253–260. дои : 10.1385/0-89603-254-x:253 . ISSN 1064-3745 . ПМИД 7509695 . S2CID 30720773 .
^ Васильева Ванд, Надина И.; Бонни, Лаура С.; Уотсон, Роберт Дж.; Грэм, Виктория; Хьюсон, Роджер (август 2018 г.). «Диагностический анализ на месте для выявления вируса Зика с использованием метода амплификации рекомбиназной полимеразы» . Журнал общей вирусологии . 99 (8): 1012–1026. дои : 10.1099/jgv.0.001083 . ISSN 1465-2099 . ПМК 6171711 . ПМИД 29897329 .
^ «PDB101: Молекула месяца: РНК-полимераза» . RCSB: PDB-101 . Проверено 15 ноября 2020 г.
^ Комптон, Дж (1991). «Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот». Природа . 350 (6313): 91–2. Бибкод : 1991Natur.350...91C . дои : 10.1038/350091a0 . ПМИД 1706072 . S2CID 4304204 .
^ Киевиц, Т; Ван Гемен, Б; Ван Стрейп, защитник; Шуккинк, Р; Диркс, М; Адриансе, Х; Малек, Л; Сукнанан, Р; Линз, П. (1991). «Изотермическая ферментативная амплификация нуклеиновых кислот NASBA in vitro, оптимизированная для диагностики инфекции ВИЧ-1». Журнал вирусологических методов . 35 (3): 273–86. дои : 10.1016/0166-0934(91)90069-c . ПМИД 1726172 .
^ Шнайдер, П; Уолтерс, Л; Шуне, Г; Шаллиг, Х; Силлекенс, П; Хермсен, Р; Зауэрвейн, Р. (2005). «Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот в реальном времени более удобна, чем ПЦР в реальном времени, для количественного определения Plasmodium falciparum» . Журнал клинической микробиологии . 43 (1): 402–5. doi : 10.1128/JCM.43.1.402-405.2005 . ПМК 540116 . ПМИД 15635001 .
^ Арно-Барбе, Надеж; Шейне Совион, Валери; Ориол, Гай; Мандранд, Бернар; Малле, Франсуа (1998). «Транскрипция РНК-матриц РНК-полимеразой Т7» . Исследования нуклеиновых кислот . 26 (15): 3550–3554. дои : 10.1093/нар/26.15.3550 . ПМЦ 147742 . ПМИД 9671817 .
^ Коллинз, РА; Ко, Л.С.; Итак, КЛ; Эллис, Т; Лау, Литва; Ю, AC (2002). «Выявление высокопатогенного и низкопатогенного гриппа птиц подтипа Н5 (евразийской линии) с использованием НАСБА». Журнал вирусологических методов . 103 (2): 213–25. дои : 10.1016/S0166-0934(02)00034-4 . ПМИД 12008015 .
^ Коллинз, РА; Ко, Л.С.; Фунг, Кентукки; Лау, Литва; Син, Дж; Ю, AC (2002). «Метод выявления основных серотипов вируса ящура». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 297 (2): 267–74. CiteSeerX 10.1.1.328.625 . дои : 10.1016/S0006-291X(02)02178-2 . ПМИД 12237113 .
^ Кейтли, MC; Силлекенс, П; Шипперс, В; Ринальдо, К; Джордж, Канзас (2005). «Обнаружение NASBA в реальном времени коронавируса, связанного с атипичной пневмонией, и сравнение с ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени» . Журнал медицинской вирусологии . 77 (4): 602–8. дои : 10.1002/jmv.20498 . ПМК 7167117 . ПМИД 16254971 .
^ Бёмер, А; Шильдген, В; Люзебринк, Дж; Зиглер, С; Тиллманн, РЛ; Кляйнс, М; Шильдген, О (2009). «Новое приложение для изотермической амплификации последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA)». Журнал вирусологических методов . 158 (1–2): 199–201. дои : 10.1016/j.jviromet.2009.02.010 . ПМИД 19428591 .
^ Мугаса, КМ; Лоран, Т; Шун, Дж.Дж.; Кагер, Пенсильвания; Лубега, ГВ; Шаллиг, HD (2009). «Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот с помощью олигохроматографии для обнаружения Trypanosoma brucei в клинических образцах» . Журнал клинической микробиологии . 47 (3): 630–5. дои : 10.1128/JCM.01430-08 . ПМК 2650916 . ПМИД 19116352 .
^ У, Цяньсинь; Суо, Чэнцюй; Браун, Том; Ван, Тэнъяо; Тейхманн, Сара А.; Бассетт, Эндрю Р. (февраль 2021 г.). «INSIGHT: Стратегия тестирования на COVID-19 в масштабе всего населения, сочетающая диагностику на месте оказания медицинской помощи с централизованным высокопроизводительным секвенированием» . Достижения науки . 7 (7): eabe5054. дои : 10.1126/sciadv.abe5054 . ISSN 2375-2548 . ПМЦ 7880595 . ПМИД 33579697 .

[1] Дейман, Биргит; ван Арле, Пьер; Силлекенс, Питер (2002). «Характеристики и применение амплификации на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA)» . Молекулярная биотехнология . 20 (2): 163–180. дои : 10.1385/мб:20:2:163 . ISSN 1073-6085 . ПМИД 11876473 . S2CID 28712952 .

[2] Рид, Адам Дж.; Коннелли, Райан П.; Уильямс, Эллисон; Тран, Майти; Шим, Бён-Шик; Чхве, Хёрён; Герасимова Юлия В. (март 2019 г.). «Безметочное обнаружение патогенов с помощью дезоксирибозимного каскада с визуальным считыванием сигнала» . Датчики и исполнительные механизмы B: Химические вещества . 282 : 945–951. дои : 10.1016/j.snb.2018.11.147 . ISSN 0925-4005 . ПМК 6713451 . ПМИД 31462856 .

[3] Лэмб, Лаура Э.; Бартолоне, Сара Н.; Дерево, Майя О.; Конвей, Майкл Дж.; Россиньоль, Жюльен; Смит, Кристофер П.; Канцлер Майкл Б. (декабрь 2018 г.). «Быстрое обнаружение вируса Зика в образцах мочи и инфицированных комарах с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией» . Научные отчеты . 8 (1): 3803. Бибкод : 2018NatSR...8.3803L . дои : 10.1038/s41598-018-22102-5 . ISSN 2045-2322 . ПМЦ 5830622 . ПМИД 29491389 .

[4] Шахтер, Юлиус (1997), «Оценка диагностических тестов — особые проблемы, возникающие при процедурах амплификации ДНК» , «Применение технологий амплификации нуклеиновых кислот для диагностики заболеваний » , Бостон, Массачусетс: Birkhäuser Boston, стр. 165–169, doi : 10.1007/978- 1-4612-2454-9_12 , ISBN 978-1-4612-7543-5 , получено 15 ноября 2020 г.

[5] Биолаборатории, Новая Англия. «Изотермическое усиление | НЭБ» . www.neb.com . Проверено 15 ноября 2020 г.

[6] Биолаборатории, Новая Англия. «Изотермическое усиление | НЭБ» . www.neb.com . Проверено 15 ноября 2020 г.

[7] Биолаборатории, Новая Англия. «Изотермическое усиление | НЭБ» . www.neb.com . Проверено 15 ноября 2020 г.

[8] Малек, Л.; Сукнанан, Р.; Комптон, Дж. (1994). Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) . Методы молекулярной биологии. Том. 28. стр. 253–260. дои : 10.1385/0-89603-254-x:253 . ISSN 1064-3745 . ПМИД 7509695 . S2CID 30720773 .

[9] Малек, Л.; Сукнанан, Р.; Комптон, Дж. (1994). Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) . Методы молекулярной биологии. Том. 28. стр. 253–260. дои : 10.1385/0-89603-254-x:253 . ISSN 1064-3745 . ПМИД 7509695 . S2CID 30720773 .

[10] Васильева Ванд, Надина И.; Бонни, Лаура С.; Уотсон, Роберт Дж.; Грэм, Виктория; Хьюсон, Роджер (август 2018 г.). «Диагностический анализ на месте для выявления вируса Зика с использованием метода амплификации рекомбиназной полимеразы» . Журнал общей вирусологии . 99 (8): 1012–1026. дои : 10.1099/jgv.0.001083 . ISSN 1465-2099 . ПМК 6171711 . ПМИД 29897329 .

[11] «PDB101: Молекула месяца: РНК-полимераза» . RCSB: PDB-101 . Проверено 15 ноября 2020 г.

[12] Комптон, Дж (1991). «Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот». Природа . 350 (6313): 91–2. Бибкод : 1991Natur.350...91C . дои : 10.1038/350091a0 . ПМИД 1706072 . S2CID 4304204 .

[13] Киевиц, Т; Ван Гемен, Б; Ван Стрейп, защитник; Шуккинк, Р; Диркс, М; Адриансе, Х; Малек, Л; Сукнанан, Р; Линз, П. (1991). «Изотермическая ферментативная амплификация нуклеиновых кислот NASBA in vitro, оптимизированная для диагностики инфекции ВИЧ-1». Журнал вирусологических методов . 35 (3): 273–86. дои : 10.1016/0166-0934(91)90069-c . ПМИД 1726172 .

[14] Шнайдер, П; Уолтерс, Л; Шуне, Г; Шаллиг, Х; Силлекенс, П; Хермсен, Р; Зауэрвейн, Р. (2005). «Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот в реальном времени более удобна, чем ПЦР в реальном времени, для количественного определения Plasmodium falciparum» . Журнал клинической микробиологии . 43 (1): 402–5. doi : 10.1128/JCM.43.1.402-405.2005 . ПМК 540116 . ПМИД 15635001 .

[15] Арно-Барбе, Надеж; Шейне Совион, Валери; Ориол, Гай; Мандранд, Бернар; Малле, Франсуа (1998). «Транскрипция РНК-матриц РНК-полимеразой Т7» . Исследования нуклеиновых кислот . 26 (15): 3550–3554. дои : 10.1093/нар/26.15.3550 . ПМЦ 147742 . ПМИД 9671817 .

[16] Коллинз, РА; Ко, Л.С.; Итак, КЛ; Эллис, Т; Лау, Литва; Ю, AC (2002). «Выявление высокопатогенного и низкопатогенного гриппа птиц подтипа Н5 (евразийской линии) с использованием НАСБА». Журнал вирусологических методов . 103 (2): 213–25. дои : 10.1016/S0166-0934(02)00034-4 . ПМИД 12008015 .

[17] Коллинз, РА; Ко, Л.С.; Фунг, Кентукки; Лау, Литва; Син, Дж; Ю, AC (2002). «Метод выявления основных серотипов вируса ящура». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 297 (2): 267–74. CiteSeerX 10.1.1.328.625 . дои : 10.1016/S0006-291X(02)02178-2 . ПМИД 12237113 .

[18] Кейтли, MC; Силлекенс, П; Шипперс, В; Ринальдо, К; Джордж, Канзас (2005). «Обнаружение NASBA в реальном времени коронавируса, связанного с атипичной пневмонией, и сравнение с ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени» . Журнал медицинской вирусологии . 77 (4): 602–8. дои : 10.1002/jmv.20498 . ПМК 7167117 . ПМИД 16254971 .

[19] Бёмер, А; Шильдген, В; Люзебринк, Дж; Зиглер, С; Тиллманн, РЛ; Кляйнс, М; Шильдген, О (2009). «Новое приложение для изотермической амплификации последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA)». Журнал вирусологических методов . 158 (1–2): 199–201. дои : 10.1016/j.jviromet.2009.02.010 . ПМИД 19428591 .

[20] Мугаса, КМ; Лоран, Т; Шун, Дж.Дж.; Кагер, Пенсильвания; Лубега, ГВ; Шаллиг, HD (2009). «Амплификация на основе последовательностей нуклеиновых кислот с помощью олигохроматографии для обнаружения Trypanosoma brucei в клинических образцах» . Журнал клинической микробиологии . 47 (3): 630–5. дои : 10.1128/JCM.01430-08 . ПМК 2650916 . ПМИД 19116352 .

[21] У, Цяньсинь; Суо, Чэнцюй; Браун, Том; Ван, Тэнъяо; Тейхманн, Сара А.; Бассетт, Эндрю Р. (февраль 2021 г.). «INSIGHT: Стратегия тестирования на COVID-19 в масштабе всего населения, сочетающая диагностику на месте оказания медицинской помощи с централизованным высокопроизводительным секвенированием» . Достижения науки . 7 (7): eabe5054. дои : 10.1126/sciadv.abe5054 . ISSN 2375-2548 . ПМЦ 7880595 . ПМИД 33579697 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]

[ 16 ]

[ 17 ]

[ 18 ]

[ 19 ]

[ 20 ]

[ 21 ]