✖


Jump to content

Рибозим вируса гепатита дельта

Edit links
Рибозим вируса гепатита дельта
Предсказанная вторичная структура и консервативность последовательности рибозима HDV
Идентификаторы
Символ HDV_рибозим
Рфам RF00094
Другие данные
РНК Тип Джин ; рибозим
Домен(ы) Вирусы
ТАК ТАК: 0000374
PDB Структуры ПДБе
Изображение трехмерной структуры рибозима вируса гепатита дельта. [ 1 ]

Рибозим вируса гепатита дельта (HDV) представляет собой некодирующую РНК, обнаруженную в вирусе гепатита дельта , которая необходима для репликации вируса. Вирус гепатита дельта — единственный известный человеческий вирус, который использует активность рибозимов для заражения своего хозяина. [ 1 ] Рибозим обрабатывает транскрипты РНК до единичных длин в реакции саморасщепления во время репликации вируса гепатита дельта, который, как полагают, распространяется по механизму двойного катящегося круга . [ 2 ] [ 3 ] Рибозим активен in vivo в отсутствие каких-либо белковых факторов и на момент своего открытия был самой быстрой из известных саморасщепляющихся РНК естественного происхождения. [ 4 ]

Кристаллическая структура этого рибозима была решена с помощью рентгеновской кристаллографии и показывает пять спиральных сегментов, соединенных двойным псевдоузлом . [ 1 ]

Помимо смысловой (геномной версии), все вирусы HDV имеют также антигеномную версию рибозима HDV. [ 5 ] Эта версия не является точной комплементарной последовательностью, но имеет ту же структуру, что и смысловая (геномная) цепь. Единственные «значительные» различия между ними — небольшая выпуклость в ножке P4 и более короткое соединение J4/2. Для репликации необходимы как геномные, так и антигеномные рибозимы. [ 2 ]

HDV-подобные рибозимы

[ редактировать ]

Рибозим HDV структурно и биохимически родствен многим другим саморасщепляющимся рибозимам. Эти другие рибозимы часто называют примерами рибозимов HDV из-за этих сходств, хотя они не обнаружены в вирусах гепатита дельта. Их также можно назвать «HDV-подобными», чтобы указать на этот факт. [ 6 ]

HDV-подобные рибозимы включают рибозим CPEB3 млекопитающих , тета-рибозимы в бактериофагах, члены ретротранспозонов (например, в элементе РНК R2 у насекомых и в L1Tc и, возможно, в других ретротранспозонах у трипаносоматид) и последовательности бактерий. [ 7 ] [ 8 ] [ 6 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] Эта группировка, вероятно, является результатом конвергентной эволюции : дельтавирус, обнаруженный вне человека, также обладает рибозимом DV, и никакие предложенные сценарии горизонтального переноса генов пока не могут объяснить это. [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]

Механизм катализа

[ редактировать ]

Рибозим HDV катализирует расщепление фосфодиэфирной связи между субстратным нуклеотидом или олигонуклеотидом и 5'-гидроксилом рибозима. В вирусе гепатита дельта эта субстратная нуклеотидная последовательность начинается с уридина и известна как U(-1), однако идентичность нуклеотида -1 существенно не меняет скорость катализа. [ 1 ] Есть только требование к ее химической природе, поскольку, как показали Перротта и Бин, замена рибозы U(-1) на дезоксирибозу отменяет реакцию, что согласуется с предсказанием, что 2'-гидроксил является нуклеофилом в химическая реакция. [ 15 ] Следовательно, в отличие от многих других рибозимов, таких как рибозим «головка молотка» , рибозим HDV не имеет предшествующих требований для катализа и требует только одного рибонуклеотида -1 в качестве субстрата для эффективной реакции. [ 1 ]

Первоначально считалось, что 75-й нуклеотид рибозима, цитозин, известный как C75, способен действовать как общее основание, при этом N3 C75 отрывает протон от 2'-гидроксила нуклеотида U(-1) для образования способствуют нуклеофильной атаке фосфодиэфирной связи. [ 1 ] Однако, хотя точно установлено, что рКа N3 C75 отличается от нормального значения 4,45 и приближается примерно к 6,15 или 6,40, [ 16 ] [ 17 ] он недостаточно нейтрален, чтобы действовать как основной катализатор. Вместо этого считается, что N3 в C75 действует как кислота Льюиса, стабилизируя уходящий 5'-гидроксил рибозима; это подтверждается его близостью к 5'-гидроксилу в кристаллической структуре. [ 1 ] [ 18 ] Замена нуклеотида С75 на любой другой нуклеотид отменяет или существенно ухудшает активность рибозима, хотя эта активность может быть частично восстановлена ​​имидазолом, что дополнительно вовлекает С75 в каталитическую активность. [ 19 ]

C75 в рибозиме HDV был предметом нескольких исследований из-за его специфической pKa. Типичные значения pKa для свободных нуклеозидов составляют от 3,5 до 4,2; эти более низкие значения pKa являются кислыми, и маловероятно, что они станут основными. Однако вполне вероятно, что структурное окружение внутри рибозима, которое включает в себя щель десольватированного активного центра, обеспечивает отрицательный электростатический потенциал, который может нарушить pKa цитозина настолько, чтобы он действовал как кислота Льюиса. [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]

Общий кислотный катализ цитозином 75, при котором протонированная форма C отдает протон уходящей группе во время катализа.

В дополнение к стабилизации уходящей 5'-гидроксильной группы кислотой Льюиса в настоящее время также признано, что рибозим HDV может использовать ион металла для активации 2'-гидроксила для атаки на нуклеотид U(-1). Ион магния в активном центре рибозима координируется с 2'-гидроксильным нуклеофилом и кислородом расщепляющегося фосфата и может действовать как кислота Льюиса, активируя 2'-гидроксил. [ 19 ] [ 18 ] Кроме того, возможно, что фосфат U23 может действовать как кислота Льюиса, принимая протон от 2'-гидроксила, при этом магний выступает в качестве координирующего иона. [ 24 ] Поскольку рибозим HDV не требует активности ионов металлов, он не является облигатным металлоферментом, но присутствие магния в активном центре значительно улучшает реакцию расщепления. Рибозим HDV, по-видимому, действительно имеет неспецифическую потребность в небольших количествах двухвалентных катионов для сворачивания, будучи активным в отношении Mg. 2+ , Как 2+ , Мн 2+ и сэр 2+ . [ 1 ] В отсутствие ионов металлов вполне вероятно, что вода может заменить магний как кислоту Льюиса.

Регуляция с помощью вышестоящей РНК

[ редактировать ]

Поскольку природа рибозима HDV быстро саморасщепляется, предыдущие эксперименты с рибонуклеазой были выполнены на 3'-продукте саморасщепления, а не на предшественнике. [ 25 ] Однако известно, что фланкирующая последовательность участвует в регуляции активности саморасщепления рибозима HDV. [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] Поэтому последовательность, расположенная выше 5' сайта саморасщепления, была включена для изучения результирующей активности рибозима HDV по саморасщеплению. [ 26 ] Были идентифицированы две альтернативные структуры.

Первая ингибирующая структура свернута расширенным транскриптом (т.е. транскриптом -30/99, координаты указаны относительно сайта саморасщепления), простирающимся от 30 нт выше сайта расщепления до 15 нт ниже 3'-конца. [ 26 ] Фланкирующая последовательность изолирует рибозим в кинетической ловушке во время транскрипции и приводит к чрезвычайно снижению скорости саморасщепления. [ 26 ] Эта структура, предотвращающая саморасщепление, включает в себя 3 альтернативных стебля: Alt1, Alt2 и Alt3, которые нарушают активную конформацию. Alt1 представляет собой участок дальнего взаимодействия длиной 10 п.н., образованный ингибирующим восходящим участком (-25/-15 нт) и нижним участком (76/86 нт). [ 26 ] Alt1 разрушает стебель P2 в активной конформации, где предполагается, что P2 играет активирующую роль как для геномного, так и для антигеномного рибозима. [ 26 ] [ 29 ] [ 30 ] Alt2 представляет собой взаимодействие между расположенной выше фланкирующей последовательностью и рибозимом, а Alt3 представляет собой ненативное взаимодействие рибозим-рибозим. [ 26 ]

Вторичная структура этой ингибирующей конформации подтверждается различными экспериментальными подходами. [ 26 ] Сначала было выполнено прямое зондирование с помощью рибонуклеаз, а последующее моделирование с помощью mfold 3.0 с использованием ограничений результатов зондирования согласуется с предложенной структурой. [ 26 ] Во-вторых, для восстановления активности рибозима использовали серию ДНК-олигомеров, комплементарных различным областям AS1/2; результаты подтверждают ингибирующую роль AS1/2. [ 26 ] В-третьих, мутационный анализ вводит одиночные/двойные мутации вне рибозима, чтобы гарантировать, что наблюдаемая активность рибозима напрямую связана со стабильностью Alt1. [ 26 ] Обнаружено, что стабильность AS1 обратно пропорциональна активности саморасщепления. [ 26 ]

Вторая пермиссивная структура позволяет рибозиму HDV саморасщепляться ко-транскрипционно, и эта структура дополнительно включает часть -54/-18 нт транскрипта РНК. [ 26 ] Вышестоящий ингибирующий участок -24/-15 из вышеупомянутой ингибирующей конформации теперь изолирован в шпильке P(-1), расположенной выше сайта расщепления. [ 26 ] [ 31 ] [ 32 ] Однако мотив P(-1) обнаруживается только в геномной последовательности, что может коррелировать с тем явлением, что геномные копии РНК HDV более распространены в инфицированных клетках печени. [ 26 ] [ 5 ] Экспериментальные данные также подтверждают эту альтернативную структуру. Во-первых, структурное картирование с помощью рибонуклеазы используется для зондирования фрагмента -54/-1 вместо всего транскрипта-предшественника из-за природы быстрого расщепления этой структуры, что согласуется с локальной шпилькой P (-1) (между -54/ -40 и -18/-30 нт). [ 26 ] Во-вторых, эволюционная консервативность обнаружена в P(-1) и области связи между P(-1) и P1 среди 21 геномного изолята РНК HDV. [ 26 ]

Использование при подготовке транскрипта РНК

[ редактировать ]

Особые свойства реакции расщепления рибозима HDV делают ее полезным инструментом для получения транскриптов РНК с гомогенными 3'-концами, что является альтернативой транскрипции РНК с помощью РНК-полимеразы Т7, которая часто может давать гетерогенные концы или нежелательные добавления. Вариант кДНК рибозима может быть получен рядом с кДНК целевой последовательности РНК и РНК, полученной транскрипцией с помощью РНК-полимеразы Т7. Последовательность рибозима будет эффективно расщеплять себя без каких-либо последующих требований, поскольку нуклеотид -1 является инвариантным, оставляя 2'-3'-циклический фосфат, который можно легко удалить обработкой фосфатазой или полинуклеотидкиназой Т4. [ 33 ] Затем целевую РНК можно очистить с помощью очистки в геле.

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час Ферре-Д'Амаре А.Р., Чжоу К., Дудна Дж.А. (октябрь 1998 г.). «Кристаллическая структура рибозима вируса гепатита дельта». Природа . 395 (6702): 567–574. Бибкод : 1998Natur.395..567F . дои : 10.1038/26912 . ПМИД   9783582 . S2CID   4359811 .
  2. ^ Перейти обратно: а б Модаль ЛЕ, Лай ММ (июль 1998 г.). «Транскрипция мРНК дельта-антигена гепатита продолжается на протяжении всей репликации вируса гепатита дельта (HDV): новая модель транскрипции и репликации РНК HDV» . Журнал вирусологии . 72 (7): 5449–5456. doi : 10.1128/JVI.72.7.5449-5456.1998 . ПМК   110180 . ПМИД   9621000 .
  3. ^ Макнотон Т.Б., Ши С.Т., Модал Л.Е., Лай М.М. (апрель 2002 г.). «Репликация РНК вируса гепатита дельта по катящемуся кругу осуществляется двумя разными клеточными РНК-полимеразами» . Журнал вирусологии . 76 (8): 3920–3927. doi : 10.1128/JVI.76.8.3920-3927.2002 . ПМК   136092 . ПМИД   11907231 .
  4. ^ Куо М.Ю., Шармин Л., Динтер-Готлиб Г., Тейлор Дж. (декабрь 1988 г.). «Характеристика саморасщепляющихся последовательностей РНК в геноме и антигеноме вируса гепатита дельта человека» . Журнал вирусологии . 62 (12): 4439–4444. doi : 10.1128/JVI.62.12.4439-4444.1988 . ПМЦ   253552 . ПМИД   3184270 .
  5. ^ Перейти обратно: а б Чен П.Дж., Калпана Г., Голдберг Дж., Мейсон В., Вернер Б., Герин Дж., Тейлор Дж. (ноябрь 1986 г.). «Структура и репликация генома вируса гепатита дельта» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (22): 8774–8778. Бибкод : 1986PNAS...83.8774C . дои : 10.1073/pnas.83.22.8774 . ПМК   387014 . ПМИД   2430299 .
  6. ^ Перейти обратно: а б Уэбб Ч., Луптак А. (2011). «HDV-подобные саморасщепляющиеся рибозимы» . Биология РНК . 8 (5): 719–727. дои : 10.4161/rna.8.5.16226 . ПМЦ   3256349 . ПМИД   21734469 .
  7. ^ Эйкбуш Д.Г., Эйкбуш TH (июль 2010 г.). «Ретротранспозоны R2 кодируют саморасщепляющийся рибозим для обработки котранскрипта рРНК» . Молекулярная и клеточная биология . 30 (13): 3142–3150. дои : 10.1128/MCB.00300-10 . ПМЦ   2897577 . ПМИД   20421411 .
  8. ^ Уэбб CH, Ричителли, Нью-Джерси, Румински DJ, Луптак А (ноябрь 2009 г.). «Широкое распространение саморасщепляющихся рибозимов» . Наука . 326 (5955): 953. Бибкод : 2009Sci...326..953W . дои : 10.1126/science.1178084 . ПМК   3159031 . ПМИД   19965505 .
  9. ^ Санчес-Луке Ф.Х., Лопес М.К., Масиас Ф., Алонсо К., Томас М.К. (октябрь 2011 г.). «Идентификация рибозима, подобного вирусу гепатита дельта, на 5'-конце мРНК ретротранспозона L1Tc из Trypanosoma cruzi» . Исследования нуклеиновых кислот . 39 (18): 8065–8077. дои : 10.1093/nar/gkr478 . ПМК   3185411 . ПМИД   21724615 .
  10. ^ Санчес-Луке Ф, Лопес МК, Масиас Ф, Алонсо К, Томас МК (январь 2012 г.). «Pr77 и L1TcRz: двойная система на 5'-конце ретротранспозона L1Tc, внутренний промотор и HDV-подобный рибозим» . Мобильные генетические элементы . 2 (1): 1–7. дои : 10.4161/mge.19233 . ПМЦ   3383444 . ПМИД   22754746 .
  11. ^ Кинбек К., Мальфертайнер Л., Зельгер-Паулюс С., Йоханнсен С., фон Меринг С., Сигель Р.К. (февраль 2024 г.). «Идентификация HDV-подобных тета-рибозимов, участвующих в перекодировании кишечных бактериофагов на основе тРНК» . Нат Коммун . 15 (1): 1559. doi : 10.1038/s41467-024-45653-w . ПМЦ   10879173 . ПМИД   38378708 .
  12. ^ Хетцель У, Шировича Л, Смура Т, Прахаузер Б, Вапалахти О, Кипар А, Хепойоки Дж (апрель 2019 г.). «Идентификация нового дельтавируса у удавов » мБио 10 (2). дои : 10.1128/mBio.00014-19 . ПМК   6445931 . ПМИД   30940697 .
  13. ^ Чанг В.С., Петтерссон Дж.Х., Ле Лэй С., Ши М., Ло Н., Вилле М., Иден Дж.С., Холмс Э.К. (июль 2019 г.). «Новые агенты, подобные гепатиту D, у позвоночных и беспозвоночных» . Эволюция вирусов . 5 (2): vez021. дои : 10.1093/ve/vez021 . ПМК   6628682 . ПМИД   31321078 .
  14. ^ Параскевопулу С., Пирцер Ф., Гольдманн Н., Шмид Дж., Корман В.М., Готтула Л.Т. и др. (июль 2020 г.). «Дельтавирус млекопитающих без коинфекции гепаднавирусом у неотропических грызунов Proechimys semispinosus » . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 117 (30): 17977–17983. Бибкод : 2020PNAS..11717977P . дои : 10.1073/pnas.2006750117 . ПМЦ   7395443 . ПМИД   32651267 .
  15. ^ Перротта А.Т., доктор медицинских наук (январь 1992 г.). «Расщепление олигорибонуклеотидов рибозимом, полученным из последовательности РНК вируса гепатита дельта». Биохимия . 31 (1): 16–21. дои : 10.1021/bi00116a004 . ПМИД   1731868 .
  16. ^ Ли Т.С., Радак Б.К., Харрис М.Э., Йорк Д.М. (2016). «Путь конформационного переключения, опосредованный двумя ионами металлов, для активации рибозима HDV» . АКС-катализ . 6 (3): 1853–1869. дои : 10.1021/acscatal.5b02158 . ПМК   5072530 . ПМИД   27774349 .
  17. ^ Гонг Б., Чен Дж.Х., Чейз Э., Чадалавада Д.М., Ядзима Р., Голден Б.Л., Бевилаква ПК, Кэри П.Р. (октябрь 2007 г.). «Прямое измерение pK (a) около нейтрального для каталитического цитозина в геномном рибозиме HDV с использованием рамановской кристаллографии». Журнал Американского химического общества . 129 (43): 13335–13342. дои : 10.1021/ja0743893 . ПМИД   17924627 .
  18. ^ Перейти обратно: а б Чен Дж. Х., Ядзима Р., Чадалавада Д. М., Чейз Э., Бевилаква ПК, Golden BL (август 2010 г.). «Кристаллическая структура предварительного расщепления рибозима HDV A 1,9 A предполагает, что как кислота Льюиса, так и общие кислотные механизмы способствуют расщеплению фосфодиэфира». Биохимия . 49 (31): 6508–6518. дои : 10.1021/bi100670p . ПМИД   20677830 .
  19. ^ Перейти обратно: а б Накано С., Proctor DJ, Bevilacqua PC (октябрь 2001 г.). «Механистическая характеристика геномного рибозима HDV: оценка каталитического и структурного вклада ионов двухвалентных металлов в механизме многоканальной реакции». Биохимия . 40 (40): 12022–12038. дои : 10.1021/bi011253n . ПМИД   11580278 .
  20. ^ Раджагопал П., Фейгон Дж. (июнь 1989 г.). «Образование трехцепочечной цепи в гомопуриновых:гомопиримидиновых ДНК-олигонуклеотидах d(GA)4 и d(TC)4». Природа . 339 (6226): 637–640. Бибкод : 1989Natur.339..637R . дои : 10.1038/339637a0 . ПМИД   2733796 . S2CID   4313895 .
  21. ^ Скленар В., Фейгон Дж. (июнь 1990 г.). «Образование стабильного триплекса из одной цепи ДНК». Природа . 345 (6278): 836–838. Бибкод : 1990Natur.345..836S . дои : 10.1038/345836a0 . ПМИД   2359461 . S2CID   4233036 .
  22. ^ Коннелл Дж.Дж., Ярус М. (май 1994 г.). «РНК с двойной специфичностью и двойные РНК с аналогичной специфичностью». Наука . 264 (5162): 1137–1141. Бибкод : 1994Sci...264.1137C . дои : 10.1126/science.7513905 . ПМИД   7513905 .
  23. ^ Лего П., Парди А. (сентябрь 1994 г.). «Зондирование протонирования аденина в РНК in situ с помощью ЯМР 13C». Журнал Американского химического общества . 116 (18): 8390–8391. дои : 10.1021/ja00097a066 .
  24. ^ Каспрович А, Кемпиньска А, Смольска Б, Вжесиньский Ю, Цеселка Ю (2015). «Применение флуоресцентно меченного трансдействующего антигеномного рибозима HDV для мониторинга взаимодействий антибиотика и РНК». Аналитические методы . 7 (24): 10414–10421. дои : 10.1039/C5AY02953H .
  25. ^ Розенштейн С.П., доктор медицинских наук (октябрь 1991 г.). «Доказательства того, что саморасщепляющиеся элементы геномной и антигеномной РНК вируса гепатита дельта имеют схожие вторичные структуры» . Исследования нуклеиновых кислот . 19 (19): 5409–5416. дои : 10.1093/нар/19.19.5409 . ПМК   328906 . ПМИД   1923826 .
  26. ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п д Чадалавада Д.М., Кнудсен С.М., Накано С., Бевилаква ПК (август 2000 г.). «Роль вышележащей структуры РНК в облегчении каталитической складки геномного рибозима вируса гепатита дельта». Журнал молекулярной биологии . 301 (2): 349–367. дои : 10.1006/jmbi.2000.3953 . ПМИД   10926514 .
  27. ^ Перротта А.Т., доктор медицинских наук (декабрь 1990 г.). «Саморасщепляющийся домен геномной РНК вируса гепатита дельта: требования к последовательности и эффекты денатуранта» . Исследования нуклеиновых кислот . 18 (23): 6821–6827. дои : 10.1093/нар/18.23.6821 . ПМЦ   332737 . ПМИД   2263447 .
  28. ^ Перротта А.Т., доктор медицинских наук (апрель 1991 г.). «Псевдоузлоподобная структура, необходимая для эффективного саморасщепления РНК вируса гепатита дельта». Природа . 350 (6317): 434–436. Бибкод : 1991Natur.350..434P . дои : 10.1038/350434a0 . ПМИД   2011192 . S2CID   4331028 .
  29. ^ Матысяк М., Вжесинский Ю., Цеселка Ю. (август 1999 г.). «Последовательное сворачивание геномного рибозима вируса гепатита дельта: структурный анализ промежуточных продуктов транскрипции РНК». Журнал молекулярной биологии . 291 (2): 283–294. дои : 10.1006/jmbi.1999.2955 . ПМИД   10438621 .
  30. ^ Перротта А.Т., Никифорова О., Бин, доктор медицинских наук (февраль 1999 г.). «Консервативный выпуклый аденозин в периферическом дуплексе антигеномной саморасщепляющейся РНК HDV уменьшает кинетический захват неактивных конформаций» . Исследования нуклеиновых кислот . 27 (3): 795–802. дои : 10.1093/нар/27.3.795 . ПМЦ   148249 . ПМИД   9889275 .
  31. ^ Мэтьюз Д.Х., Сабина Дж., Цукер М., Тернер Д.Х. (май 1999 г.). «Расширенная зависимость термодинамических параметров от последовательности улучшает предсказание вторичной структуры РНК» . Журнал молекулярной биологии . 288 (5): 911–940. дои : 10.1006/jmbi.1999.2700 . ПМИД   10329189 .
  32. ^ Цукер М., Мэтьюз Д., Тернер Д. (1999). «Алгоритмы и термодинамика для предсказания вторичной структуры РНК. Практическое руководство». В Кларке Дж.Б. (ред.). Биохимия и биотехнология РНК . Серия НАТО ASI. Дордрехт, Нидерланды: Kluwer Academic Publishers.
  33. ^ Вихлач А., Легевич М., Цеселка Ю. (февраль 2004 г.). «Генерация in vitro транскриптов с гомогенными 3'-концами с использованием транс-действующего антигеномного дельта-рибозима» . Исследования нуклеиновых кислот . 32 (3): 39д–39. дои : 10.1093/нар/gnh037 . ПМЦ   373431 . ПМИД   14973333 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Hepatitis_delta_virus_ribozyme&oldid=1234859830"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 735b555bcb5368297fffa6a27a2206fc__1721128980
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/73/fc/735b555bcb5368297fffa6a27a2206fc.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Hepatitis delta virus ribozyme - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)