Ингибиторы полимеразной цепной реакции
Ингибиторы ПЦР представляют собой любой фактор, который предотвращает амплификацию нуклеиновых кислот посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). [ 1 ] Ингибирование ПЦР является наиболее распространенной причиной неудачи амплификации при наличии достаточного количества копий ДНК. [ 2 ] Ингибиторы ПЦР обычно влияют на ПЦР посредством взаимодействия с ДНК или вмешательства в ДНК-полимеразу . Ингибиторы могут избежать удаления во время процедуры очистки ДНК, связываясь непосредственно с одно- или двухцепочечной ДНК. [ 3 ] Альтернативно, за счет снижения доступности кофакторов (таких как Mg 2+ ) или иным образом препятствуя их взаимодействию с ДНК-полимеразой, ПЦР ингибируется. [ 3 ]
В реакции мультиплексной ПЦР различные последовательности могут в разной степени подвергаться разным ингибирующим эффектам, что приводит к несоответствию их относительных амплификаций. [ 3 ]
Виды ингибиторов
[ редактировать ]Ингибиторы могут присутствовать в исходном образце, таком как кровь, ткани, ткани и почва, но также могут быть добавлены в результате обработки образца и используемых методов экстракции ДНК. [ 3 ] Избыточные соли, включая KCl и NaCl, ионные детергенты , такие как деоцихолат натрия , саркозил и SDS , этанол, изопропанол и фенол, среди других, способствуют снижению эффективности ПЦР посредством различных ингибирующих механизмов. [ 3 ]
Количественная оценка степени ингибирования
[ редактировать ]Чтобы попытаться оценить степень ингибирования реакции, можно провести контроль путем добавления известного количества шаблона к исследуемой реакционной смеси (на основе анализируемого образца). Сравнивая амплификацию этой матрицы в смеси с амплификацией, наблюдаемой в отдельном эксперименте, в котором та же матрица использовалась в отсутствие ингибиторов, можно сделать вывод о степени ингибирования в исследуемой реакционной смеси. [ 4 ] [ 3 ] Конечно, если какая-либо часть ингибирования, происходящего в полученной из образца реакционной смеси, является специфичной для последовательности, то этот метод даст заниженную оценку ингибирования применительно к исследуемой последовательности(ям).
Предотвращение ингибирования ПЦР
[ редактировать ]Коллекция образцов
[ редактировать ]Метод отбора проб можно усовершенствовать, чтобы избежать ненужного сбора ингибиторов. Например, в судебно-медицинской экспертизе перенос мазка крови на ткань или слюны на пищу может предотвратить или уменьшить загрязнение ингибиторами, присутствующими в ткани или пище. [ 3 ]
очистка ДНК
[ редактировать ]Существуют методы и коммерчески доступны наборы, позволяющие экстрагировать ДНК без использования некоторых ингибиторов. [ 3 ]
Компоненты реакции ПЦР
[ редактировать ]Помимо методов удаления ингибиторов из образцов перед ПЦР, некоторые ДНК-полимеразы обладают различной устойчивостью к различным ингибиторам, а увеличение концентрации выбранной ДНК-полимеразы также придает некоторую устойчивость к ингибиторам, нацеленным на полимеразу. [ 3 ]
При ПЦР на образцах крови добавление бычьего сывороточного альбумина снижает влияние некоторых ингибиторов на ПЦР. [ 3 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Уилсон, Ян (октябрь 1997 г.). «Ингибирование и облегчение амплификации нуклеиновых кислот» . Прикладная и экологическая микробиология . 63 (10): 3741–3751. Бибкод : 1997ApEnM..63.3741W . doi : 10.1128/aem.63.10.3741-3751.1997 . ПМК 168683 . ПМИД 9327537 .
- ^ Алаеддини, Реза (2012). «Судебно-медицинские последствия ингибирования ПЦР - обзор». Международная судебно-медицинская экспертиза: Генетика . 6 (3): 297–305. дои : 10.1016/j.fsigen.2011.08.006 . ПМИД 21917539 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж «Введение в ингибиторы ПЦР (Promega Corporation)» (PDF) . Проверено 15 декабря 2007 г.
- ^ Гифферс Дж., Ройше Э., Сольбах В., Маасс М. (2000). «Неспособность обнаружить Chlamydia pneumoniae в срезах головного мозга пациентов с болезнью Альцгеймера» . Дж. Клин. Микробиол . 38 (2): 881–2. doi : 10.1128/JCM.38.2.881-882.2000 . ПМЦ 86233 . ПМИД 10655406 .