Оптимизация полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это широко используемый инструмент молекулярной биологии для амплификации ДНК, а также различные методы оптимизации ПЦР , разработанные молекулярными биологами для улучшения производительности ПЦР и минимизации неудач.
Загрязнение и ПЦР
[ редактировать ]Метод ПЦР чрезвычайно чувствителен: для амплификации на несколько порядков требуется всего несколько молекул ДНК в одной реакции. адекватные меры, чтобы избежать загрязнения любой ДНК, присутствующей в лабораторной среде ( бактериями , вирусами Поэтому необходимы или человеческими источниками). Поскольку продукты предыдущих ПЦР-амплификаций являются распространенным источником загрязнения, многие лаборатории молекулярной биологии внедрили процедуры, предполагающие разделение лаборатории на отдельные зоны. [1] Одно отделение лаборатории предназначено для подготовки и обработки реагентов для пре-ПЦР и организации реакции ПЦР, а другое — для пост-ПЦР-обработки, такой как гель-электрофорез или очистка продуктов ПЦР. Для постановки реакций ПЦР многие стандартные рабочие процедуры включают использование пипеток с фильтрующими наконечниками и ношение свежих лабораторных перчаток , а в некоторых случаях - ламинарного бокса с УФ-лампой в качестве рабочей станции (для уничтожения любых образований экстранеомультимеров ). ПЦР обычно оценивается по реакции отрицательного контроля , которая проводится идентично экспериментальной ПЦР, но без матричной ДНК и выполняется одновременно с экспериментальной ПЦР.
Шпильки
[ редактировать ]Вторичные структуры ДНК могут привести к сворачиванию или завязыванию матрицы ДНК или праймеров, что приводит к снижению выхода продукта или сбою реакции. Шпильки , которые состоят из внутренних складок, возникающих в результате спаривания оснований между нуклеотидами в инвертированных повторах одноцепочечной ДНК, представляют собой распространенные вторичные структуры и могут привести к неудачным результатам ПЦР.
Обычно конструкция праймера включает проверку потенциальных вторичных структур в праймерах или добавление ДМСО или глицерина в ПЦР для минимизации вторичных структур в матрице ДНК. [2] используются для оптимизации ПЦР, которые имели историю неудач из-за подозрения на наличие шпилек ДНК.
Ошибки полимеразы
[ редактировать ]Taq-полимераза не обладает от 3' до 5' экзонуклеазной активностью . Таким образом, Taq не обладает активностью по проверке ошибок , которая заключается в удалении любого вновь неправильно включенного нуклеотидного основания из зарождающейся (т. е. расширяющейся) цепи ДНК, которая не совпадает с противоположным основанием в комплементарной цепи ДНК. Отсутствие корректуры от 3' до 5' фермента Taq приводит к высокой частоте ошибок (мутаций на нуклеотид за цикл) примерно 1 на 10 000 оснований, что влияет на точность ПЦР, особенно если ошибки возникают на ранних этапах ПЦР с низкие количества исходного материала, вызывающие накопление большой доли амплифицированной ДНК с неправильной последовательностью в конечном продукте. [3]
Стали доступными несколько «высокоточных» термостабильных ДНК-полимераз , обладающих экзонуклеазной активностью от 3' до 5', которые позволяют более точную амплификацию для использования в ПЦР для секвенирования или клонирования продуктов. Примеры полимераз с экзонуклеазной активностью от 3' до 5' включают: ДНК-полимеразу KOD, рекомбинантную форму Thermococcus kodakaraensis KOD1; Vent, который извлекается из Thermococcus Litoralis ; ДНК-полимераза Pfu , выделенная из Pyrococcus Furiosus ; Pwo, который извлекается из Pyrococcus woesii ; [4] Полимераза Q5 с точностью амплификации в 280 раз выше, чем у Taq . [5]
Концентрация магния
[ редактировать ]Магний необходим в качестве кофактора термостабильной ДНК-полимеразы. Taq-полимераза представляет собой магний-зависимый фермент, и определение оптимальной концентрации имеет решающее значение для успеха реакции ПЦР. [6] Некоторые компоненты реакционной смеси, такие как концентрация матрицы, dNTP и присутствие хелатирующих агентов ( ЭДТА ) или белков, могут уменьшать количество присутствующего свободного магния, тем самым снижая активность фермента. [7] Праймеры, которые связываются с неправильными сайтами матрицы, стабилизируются в присутствии чрезмерных концентраций магния, что приводит к снижению специфичности реакции. Чрезмерные концентрации магния также стабилизируют двухцепочечную ДНК и предотвращают полную денатурацию ДНК во время ПЦР, снижая выход продукта. [6] [7] Недостаточное оттаивание MgCl 2 может привести к образованию градиентов концентрации в растворе хлорида магния , снабжаемом ДНК-полимеразой, а также способствует возникновению многих неудачных экспериментов. [7]
Размер и другие ограничения
[ редактировать ]ПЦР легко работает с матрицей ДНК длиной от двух до трех тысяч пар оснований. Однако при превышении этого размера выход продукта часто снижается, поскольку с увеличением длины стохастические эффекты, такие как преждевременное терминирование полимеразой, начинают влиять на эффективность ПЦР. Можно амплифицировать более крупные фрагменты длиной до 50 000 пар оснований с помощью более медленного цикла нагрева и специальных полимераз. Это полимеразы, слитые с ДНК-связывающим белком, повышающим процессивность, усиливающим прилипание полимеразы к ДНК. [8] [9]
Другие ценные свойства химерных полимераз TopoTaq и PfuC2 включают повышенную термостабильность, специфичность и устойчивость к примесям и ингибиторам . [10] [11] Они были созданы с использованием уникальных ДНК-связывающих доменов «спираль-шпилька-спираль» (HhH) топоизомеразы V. [12] от гипертермофила Methanopyrus kandleri . Химерные полимеразы преодолевают многие ограничения нативных ферментов и используются при прямой ПЦР-амплификации клеточных культур и даже образцов пищевых продуктов , минуя трудоемкие этапы выделения ДНК. Высокая активность гибридной полимеразы TopoTaq по смещению цепей помогает решить проблемы ПЦР, которые могут быть вызваны шпильками и G-нагруженными двойными спиралями. Спирали с высоким содержанием GC обладают более высокой температурой плавления, что часто ухудшает ПЦР в зависимости от условий. [13]
Неспецифическое грунтование
[ редактировать ]Неспецифическое связывание праймеров происходит часто и может происходить по нескольким причинам. К ним относятся повторяющиеся последовательности в матрице ДНК, неспецифическое связывание между праймером и матрицей, высокое или низкое содержание GC в матрице или неполное связывание праймера, при котором 5'-конец праймера остается неприкрепленным к матрице. неспецифическое связывание вырожденных праймеров Также распространено . Манипулирование температурой отжига и концентрацией ионов магния можно использовать для повышения специфичности. Например, более низкие концентрации магния или других катионов могут предотвратить неспецифическое взаимодействие праймеров, что обеспечивает успешную ПЦР. Фермент-полимераза «горячего старта», активность которого блокируется, если он не нагревается до высокой температуры (например, 90–98˚C) во время стадии денатурации первого цикла, обычно используется для предотвращения неспецифического прайминга во время приготовления реакции при более низкие температуры. Химически опосредованные ПЦР с горячим стартом требуют более высоких температур и более длительного времени инкубации для активации полимеразы по сравнению с ПЦР с горячим стартом на основе антител или аптамеров. [ нужна ссылка ]
Другие методы повышения специфичности включают вложенную ПЦР и ПЦР приземления .
Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в разработке праймера. [14]
Полимеразная цепная реакция приземления или полимеразная цепная реакция в стиле приземления - это метод полимеразной цепной реакции, с помощью которого праймеры позволяют избежать амплификации неспецифических последовательностей. Температура отжига во время полимеразной цепной реакции определяет специфичность отжига праймеров. Температура плавления праймера устанавливает верхний предел температуры отжига. При температурах чуть ниже этой точки будет происходить только очень специфическое спаривание оснований между праймером и матрицей. При более низких температурах праймеры связываются менее специфично. Неспецифическое связывание праймера скрывает результаты полимеразной цепной реакции, поскольку неспецифические последовательности, с которыми праймеры отжигаются на ранних стадиях амплификации, «вытесняют» любые специфические последовательности из-за экспоненциального характера амплификации полимеразы.
Самые ранние этапы цикла полимеразной цепной реакции приземления имеют высокие температуры отжига. Температуру отжига поэтапно снижают для каждой последующей серии циклов (количество отдельных циклов и шаг понижения температуры выбирает экспериментатор). Праймер будет отжигаться при самой высокой температуре, которая наименее допускает неспецифическое связывание, которое он способен выдержать. Таким образом, первая амплифицированная последовательность находится между областями наибольшей специфичности праймера; наиболее вероятно, что это и есть интересующая последовательность. Эти фрагменты будут далее амплифицироваться во время последующих раундов при более низких температурах и будут конкурировать с неспецифическими последовательностями, с которыми праймеры могут связываться при этих более низких температурах. Если праймер первоначально (во время фаз более высоких температур) связывается с интересующей последовательностью, последующие раунды полимеразной цепной реакции могут быть проведены с продуктом для дальнейшей амплификации этих фрагментов.
Праймеры-димеры
[ редактировать ]Отжиг 3'-конца одного праймера с самим собой или второго праймера может вызвать удлинение праймера, что приводит к образованию так называемых димеров праймера, видимых в виде низкомолекулярных полос на ПЦР-гелях . [15] Образование димера праймера часто конкурирует с образованием интересующего фрагмента ДНК, и этого можно избежать, используя праймеры, которые сконструированы таким образом, что им не хватает комплементарности - особенно на 3'-концах - самому себе или другому праймеру, используемому в реакции. Если дизайн праймера ограничен другими факторами и если димеры праймеров все же встречаются, методы ограничения их образования могут включать оптимизацию концентрации MgCl 2 или увеличение температуры отжига в ПЦР. [15]
Дезоксинуклеотиды
[ редактировать ]Дезоксинуклеотиды (dNTP) могут связывать Mg. 2+ ионов и тем самым влияют на концентрацию свободных ионов магния в реакции. Кроме того, чрезмерное количество dNTP может увеличить частоту ошибок ДНК-полимеразы и даже ингибировать реакцию. [6] [7] Дисбаланс в пропорциях четырех dNTP может привести к неправильному включению во вновь сформированную цепь ДНК и способствовать снижению точности ДНК-полимеразы. [16]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Балин Б.Дж., Жерар Х.К., Аркинг Э.Дж. и др. (1998). «Идентификация и локализация Chlamydia pneumoniae в мозге при болезни Альцгеймера». Мед. Микробиол. Иммунол . 187 (1): 23–42. дои : 10.1007/s004300050071 . ПМИД 9749980 . S2CID 25307947 .
При всех анализах соблюдалась крайняя осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения как анализируемых образцов нуклеиновых кислот, так и реакционных смесей; такие меры включали подготовку нуклеиновых кислот в лаборатории, отдельной от тех, в которых проводились анализы ПЦР или обратной транскрипции (ОТ)-ПЦР, а также использование восьми различных биологических зонтов, каждый в отдельной лаборатории, для постановки реакций.
- ^ «Часто задаваемые вопросы по полимеразам и амплификации» . Биолаборатории Новой Англии.
- ^ Эккерт К.А., Кункель Т.А. (август 1991 г.). «Правильность ДНК-полимеразы и полимеразная цепная реакция» . Геномные исследования . 1 (1): 17–24. дои : 10.1101/гр.1.1.17 . ПМИД 1842916 .
- ^ Лундберг, Келли С.; Шумейкер, Дэн Д.; Адамс, Майкл WW; Шорт, Джей М.; Зорге, Джозеф А.; Матур, Эрик Дж. (1991). «Высокоточная амплификация с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из Pyrococcus Furiosus». Джин . 108 (1): 1–6. дои : 10.1016/0378-1119(91)90480-у . ПМИД 1761218 .
- ^ Биолаборатории Новой Англии. «Высококачественная ДНК-полимераза Q5®». Доступный .
- ^ Jump up to: а б с Маркулатос П., Сифакас Н., Монкани М. (2002). «Мультиплексная полимеразная цепная реакция: практический подход» . Дж. Клин. Лаб. Анал . 16 (1): 47–51. дои : 10.1002/jcla.2058 . ПМК 6808141 . ПМИД 11835531 .
- ^ Jump up to: а б с д «Протоколы и рекомендации по амплификации нуклеиновых кислот» . Архивировано из оригинала 2 февраля 2009 г. Проверено 28 января 2009 г.
{{cite journal}}: Для цитирования журнала требуется|journal=( помощь ) - ^ Павлов А.Р., Белова Г.И., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2002). «Мотивы спираль-шпилька-спираль придают химерным ДНК-полимеразам солеустойчивость и процессивность» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 99 (21): 3510–13515. Бибкод : 2002PNAS...9913510P . дои : 10.1073/pnas.202127199 . ПМК 129704 . ПМИД 12368475 .
- ^ Демидов В.В. (2002). «Счастливый брак: развитие ДНК-полимеразы с помощью добавок ДНК-топоизомеразы». Тенденции Биотехнологии . 20 (12): 491. doi : 10.1016/S0167-7799(02)02101-7 .
- ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2004). «Последние разработки в области оптимизации термостабильных ДНК-полимераз для эффективного применения». Тенденции Биотехнологии . 22 (5): 253–260. дои : 10.1016/j.tibtech.2004.02.011 . ПМИД 15109812 .
- ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2004). «Термостабильные химерные ДНК-полимеразы с высокой устойчивостью к ингибиторам» . Амплификация ДНК: современные технологии и приложения . Горизонт Бионауки. стр. 3–20. ISBN 0-9545232-9-6 .
- ^ Фортерре П (2006). «ДНК-топоизомераза V: новая складка загадочного происхождения» . Тенденции Биотехнологии . 24 (6): 245–247. дои : 10.1016/j.tibtech.2006.04.006 . ПМИД 16650908 .
- ^ Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2006). «Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибрида TopoTaq с другими ферментами» . В Келечаве Дж. (ред.). Секвенирование ДНК II: оптимизация подготовки и очистки . Джонс и Бартлетт. стр. 241–257. ISBN 0-7637-3383-0 .
- ^ «Электронный ПЦР» . NCBI — Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 13 марта 2012 г.
- ^ Jump up to: а б Крамер М.Ф., Коэн Д.М. (август 2006 г.). «Ферментативная амплификация ДНК методом ПЦР: стандартные процедуры и оптимизация». Карр Проток Цитом . Приложение 3: А.3К.1–А.3К.15. дои : 10.1002/0471142956.cya03ks37 . ПМИД 18770830 . S2CID 4658404 .
- ^ Кунц Б.А., Кохалми С.Е. (1991). «Модуляция мутагенеза уровнями дезоксирибонуклеотидов». Анну. Преподобный Жене . 25 : 339–59. дои : 10.1146/annurev.ge.25.120191.002011 . ПМИД 1812810 .