ПРАЙМ (техника маркировки)
PRIME ( включение зондов, опосредованное ферментами ) — это исследовательский инструмент в области молекулярной биологии, разработанный Алисой Ю. Тинг и лабораторией Тинг в Массачусетском технологическом институте для сайт-специфического мечения белков в живых клетках с помощью химических зондов. [1] [2] Зонды часто обладают полезными биофизическими свойствами, такими как флуоресценция , и позволяют визуализировать белки. [1] В конечном счете, PRIME позволяет ученым изучать функции конкретных белков, представляющих интерес.
Значение
[ редактировать ]Мечение белков флуоресцентными молекулами позволяет визуализировать динамику белков, их локализацию и межбелковые взаимодействия и, следовательно, служит важным методом для понимания функций и сетей белков в живых клетках. [3] Мечение белка должно иметь высокую селективность по отношению к интересующему белку и не должно мешать естественным функциям белка. Хотя генетическое кодирование флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), является наиболее популярным методом из-за его высокой специфичности, флуоресцентные белки, вероятно, будут мешать функциям белка, с которым они слиты, из-за своих больших размеров. . [3] Существует множество инструментов маркировки, таких как HaloTag, SNAP tag и FlAsH, разработанных для преодоления недостатков традиционного мечения белков флуоресцентными белками. Однако они все же имеют существенные недостатки либо из-за большого размера метки, либо из-за низкой специфичности процесса маркировки. [4] PRIME был разработан для достижения высокой специфичности мечения, сравнимой с флуоресцентными белками с небольшими молекулами. [4]
Принципы
[ редактировать ]В PRIME мутантный фермент LplA (лигаза липоевой кислоты из Escherichia coli ) сначала катализирует конъюгацию «ручки функциональной группы» и акцепторного пептида LplA (LAP), который генетически слит с интересующим белком. [1] [4] [5] «Дескриптор функциональной группы» обозначает молекулу-мостик, соединяющую метку LAP с флуоресцентным зондом или флуорофором . Флуоресцентный зонд реагирует с «ручкой функциональной группы», соединенной с меткой, и в конечном итоге маркирует интересующий белок. Для присоединения флуоресцентного зонда к комплексу, состоящему из белка, метки LAP и мостика, можно использовать различные химические реакции: реакция Дильса-Альдера , [6] и азид-алкиновое циклоприсоединение, катализируемое медью (CuAAC) с помощью хелатирования (см. Азид-алкиновое циклоприсоединение Хейсгена ). [7] Две другие версии технологий мечения PRIME используют мутантные белки LplA для непосредственного включения флуорофора в интересующий белок, меченный LAP. [8] [9]
Ограничения
[ редактировать ]Несмотря на преимущества PRIME перед другими методами маркировки, PRIME все же имеет некоторые возможные ограничения. Прежде всего, метка LAP может влиять на функцию белков, с которыми она слита. [1] Экспериментаторам рекомендуется проводить контрольные эксперименты, чтобы убедиться в правильности функционирования меченого рекомбинантного белка. [1] Во-вторых, даже в низкой концентрации химические вещества, такие как флуоресцентный зонд, могут быть токсичными для клеток. [1] Экспериментаторам также необходимо добиться правильного баланса между максимальным сигналом флуоресценции и минимальным нарушением клеточной функции. [1]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д и ж г Уттамапинант С., Санчес М.И., Лю Д.С., Яо Дж.З., Тинг А.Ю. (август 2013 г.). «Сайт-специфическая маркировка белков с использованием PRIME и клик-химии с помощью хелатирования» . Нат Проток . 8 (8): 1620–34. дои : 10.1038/нпрот.2013.096 . ПМЦ 4892701 . ПМИД 23887180 .
- ^ Чеше Х, изд. Методы биохимии белков . Берлин: Де Грюйтер. ISBN 978-3-11-025236-1 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Со Н. (19 февраля 2008 г.). «Селективное химическое мечение белков небольшими флуоресцентными молекулами на основе методологии металл-хелатирования» . Датчики . 8 (2): 1004–1024. Бибкод : 2008Senso...8.1004S . дои : 10.3390/s8021004 . ПМЦ 3927527 . ПМИД 27879749 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Яо Дж.З., Уттамапинант С., Полухтин А., Баскин Дж.М., Коделли Дж.А., Слеттен Э.М., Бертоцци Ч.Р., Попик В.В., Тинг А.Ю. (2012). «Нацеливание флуорофора на клеточные белки посредством ферментативного лигирования азидов и стимулируемого штаммом циклоприсоединения» . Дж. Ам. хим. Соц . 134 (8): 3720–8. дои : 10.1021/ja208090p . ПМК 3306817 . ПМИД 22239252 .
- ^ Демченко А.П., Брауэр А.М., изд. (2011). Передовые репортеры флуоресценции в химии и биологии . Гейдельберг: Спрингер. ISBN 978-3-642-18034-7 .
- ^ Лю Д.С., Тангпирачайкул А., Сельварадж Р., Тейлор М.Т., Фокс Дж.М., Тинг А.Ю. (2012). «Циклоприсоединение Дильса-Альдера для нацеливания флуорофора на определенные белки внутри живых клеток» . Дж. Ам. хим. Соц . 134 (2): 792–5. дои : 10.1021/ja209325n . ПМК 3381951 . ПМИД 22176354 .
- ^ Уттамапинант С., Тангпирачайкул А., Гресиан С., Кларк С., Сингх У., Слэйд П., Джи КР, Тинг А.Ю. (2012). «Быстрая, совместимая с клетками клик-химия с медь-хелатирующими азидами для биомолекулярной маркировки» . Энджью. хим. Межд. Эд. англ . 51 (24): 5852–6. дои : 10.1002/anie.201108181 . ПМК 3517120 . ПМИД 22555882 .
- ^ Уттамапинант К., Уайт К.А., Баруа Х., Томпсон С., Фернандес-Суарес М., Путенвитил С., Тинг А.Ю. (2010). «Флуорофорлигаза для сайт-специфической маркировки белков внутри живых клеток» . Proc Natl Acad Sci США . 107 (24): 10914–9. дои : 10.1073/pnas.0914067107 . ПМЦ 2890758 . ПМИД 20534555 .
- ^ Лю Д.С., Нивон Л.Г., Рихтер Ф., Голдман П.Дж., Диринк Т.Дж., Яо Дж.З., Фиппс В.С., Эллисман М.Х., Дреннан К.Л., Бейкер Д., Тинг А.Ю. (2014). «Вычислительный дизайн красной флуорофорлигазы для сайт-специфической маркировки белков в живых клетках» . Proc Natl Acad Sci США . 111 (43): E4551–9. Бибкод : 2014PNAS..111E4551L . дои : 10.1073/pnas.1404736111 . ПМК 4217414 . ПМИД 25313043 .