FMN-связывающий флуоресцентный белок
FMN -связывающий флуоресцентный белок ( FbFP ), также известный как флуоресцентный белок на основе LOV , представляет собой небольшой кислороднезависимый флуоресцентный белок, который связывает флавинмононуклеотид (FMN) в качестве хромофора .
Они были разработаны на основе рецепторов синего света (так называемых LOV-доменов ), обнаруженных в растениях и различных бактериях. [1] Они дополняют GFP -производные и –гомологи и характеризуются независимостью от молекулярного кислорода и малым размером. FbFP поглощают синий свет и излучают свет в голубо-зеленом спектральном диапазоне.
Разработка
[ редактировать ]LOV-домены представляют собой подкласс доменов PAS и впервые были идентифицированы у растений как часть фототропина , который играет важную роль в росте растений к свету. [2] Они нековалентно связывают флавинмононуклеотид (FMN) в качестве кофактора. Благодаря связыванию FMN LOV-домены проявляют собственную флуоресценцию, однако очень слабую. При освещении синим светом LOV-домены подвергаются фотоциклу, во время которого образуется ковалентная связь между консервативным остатком цистеина и FMN. Это вызывает конформационное изменение белка, необходимое для распространения сигнала, а также приводит к потере флуоресценции. Ковалентная связь энергетически невыгодна и расщепляется с постоянной времени, зависящей от белка, от секунд до часов. [3] [4] [5] Чтобы лучше использовать флуоресцентные свойства этих белков, естественный фотоцикл этих LOV-доменов был отменен путем замены консервативного цистеина на аланин на генетическом уровне. Таким образом, при облучении синим светом белок остается во флуоресцентном состоянии и также проявляет более яркую флуоресценцию. [1]
Первые FbFP, полученные таким образом, впоследствии были дополнительно оптимизированы с использованием различных методов мутагенеза. Особенно яркость [6] [7] [8] но и фотостабильность [2] белков были усилены, а их спектральные характеристики изменены. [8]
Спектральные характеристики
[ редактировать ]
Обычно FbFP имеют максимум возбуждения при длине волны примерно 450 нм (синий свет) и второй отчетливый пик возбуждения около 370 нм (УФ-А свет). Основной пик выбросов приходится на ок. 495 нм, с плечом около 520 нм. Один вариант Pp2FbFP (Q116V) демонстрирует синий сдвиг на 10 нм как в спектрах возбуждения, так и в спектрах излучения. [8] Рационально разработанные варианты iLOV и CagFbFP демонстрируют красное смещение на 6 и 7 нм соответственно. [9]
Фотофизические свойства
[ редактировать ]Фотофизические свойства FbFP определяются самим хромофором и его химическим окружением в белке. Коэффициент поглощения (ε) составляет около 14,200 M. −1 см −1 при 450 нм для всех описанных FbFP, что несколько выше, чем у свободного FMN (ε = 12,200 М −1 см −1 [10] ). флуоресценции Квантовый выход (Φ) значительно варьируется между различными FbFP и колеблется от 0,2 (phiLOV2.1) до 0,44 (EcFbFP и iLOV). [6] [8] Это представляет собой почти двукратное увеличение по сравнению со свободным FMN (Φ = 0,25 [8] ).
Отличие от свободного ФМН еще более существенно в случае фотостабильности, устойчивости белков к обесцвечиванию при длительном и интенсивном облучении синим светом. На основе полупериода обесцвечивания (времени, необходимого для снижения начальной интенсивности флуоресценции до 50% при освещении) создан генно-инженерный вариант phiLOV2.1. [2] примерно в 40 раз стабильнее бесплатного FMN. Этот стабилизирующий эффект можно наблюдать практически для всех FbFP, хотя обычно он находится в пределах 5х – 10х. [8]
Среднее время жизни флуоресценции FbFP находится в диапазоне 3,17 (Pp2FbFP) и 5,7 нс (например, EcFbFP). [8] Таким образом, они намного длиннее, чем у производных GFP, которые обычно составляют от 1,5 до 3 нс. [11] [12]
Таким образом, FbFP хорошо подходят в качестве донорных доменов в системах резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) в сочетании с производными GFP, такими как YFP, в качестве акцепторных доменов.
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]Основным преимуществом FbFP перед GFP является их независимость от молекулярного кислорода. Поскольку всем производным и гомологам GFP для созревания хромофора необходим молекулярный кислород, эти флуоресцентные белки имеют ограниченное применение в анаэробных или гипоксических условиях. [13]
Поскольку FbFP связывают FMN как хромофор, который синтезируется независимо от молекулярного кислорода, их сигнал флуоресценции не различается в аэробных и анаэробных условиях. [1] [14]
Еще одним преимуществом является небольшой размер FbFP, который обычно составляет от 100 до 150 аминокислот . Это примерно вдвое меньше GFP (238 аминокислот). Например, можно было бы показать, что это делает их превосходными метками для мониторинга инфекций вируса табачной мозаики в листьях табака. [6]
Благодаря необычайно длительному среднему времени жизни флуоресценции (до 5,7 нс) они также очень хорошо подходят для использования в качестве донорных доменов в системах FRET в сочетании, например, с YFP (см. фотофизические свойства). Слияние EcFbFP и YFP было, например, использовано для разработки первого генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора кислорода (FluBO). [15]
Основным недостатком по сравнению с вариантами GFP является их меньшая яркость (произведение ε и Φ). Обычно используемый EGFP (ε = 55 000 M −1 см −1 ; Φ = 0,60 [16] ), например, примерно в пять раз ярче, чем EcFbFP.
Еще одним недостатком FbFP является отсутствие цветовых вариантов для маркировки и различения нескольких белков в одной клетке или ткани. Наибольший спектральный сдвиг, зарегистрированный для FbFP, составляет 10 нм. Хотя этот вариант (Pp2FbFP Q116V) можно визуально отличить от других человеческим глазом, [8] спектральные различия слишком малы для фильтров флуоресцентной микроскопии.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Дреппер Т., Эггерт Т., Цирколоне Ф., Хек А., Краусс Ю., Гутерл Дж. К., Вендорф М., Лоси А., Гертнер В., Джагер К. Э. (2007). «Репортерные белки для флуоресценции in vivo без кислорода». Нат Биотехнология . 25 (4): 443–445. дои : 10.1038/nbt1293 . ПМИД 17351616 . S2CID 7335755 .
- ^ Перейти обратно: а б с Кристи Дж.М., Реймонд П., Пауэлл Г.К., Бернаскони П., Райбекас А.А., Лискум Э., Бриггс В.Р. (1998). «Арабидопсис NPH1: флавопротеин со свойствами фоторецептора фототропизма». Наука . 282 (5394): 1698–1701. Бибкод : 1998Sci...282.1698C . дои : 10.1126/science.282.5394.1698 . ПМИД 9831559 .
- ^ Цирколоне Ф., Гранзин Дж., Йенч К., Дреппер Т., Джагер К.Е., Уиллболд Д., Краусс Ю., Батра-Сафферлинг Р. (2012). «Структурная основа медленного восстановления в темноте полноразмерного белка LOV из Pseudomonas putida». Дж Мол Биол . 417 (4): 362–374. дои : 10.1016/j.jmb.2012.01.056 . ПМИД 22326872 .
- ^ Лоси, А.; Гертнер, В. (2011). «Старые хромофоры, новые парадигмы фотоактивации, модные применения: флавины в фоторецепторах LOV и BLUF» . Фотохим Фотобиол . 87 (3): 491–510. дои : 10.1111/j.1751-1097.2011.00913.x . ПМИД 21352235 .
- ^ Кроссон, С.; Моффат, К. (2001). «Структура домена фоторецептора флавин-связывающего растения: понимание светоопосредованной передачи сигнала» . Proc Natl Acad Sci США . 98 (6): 2995–3000. Бибкод : 2001PNAS...98.2995C . дои : 10.1073/pnas.051520298 . ПМК 30595 . ПМИД 11248020 .
- ^ Перейти обратно: а б с Чепмен С., Фолкнер С., Кайзерли Э., Гарсиа-Мата С., Савенков Е.И., Робертс А.Г., Опарка К.Дж., Кристи Дж.М. (2008). «Фотообратимый флуоресцентный белок iLOV превосходит GFP в качестве репортера вирусной инфекции растений» . Proc Natl Acad Sci США . 105 (50): 20038–20043. Бибкод : 2008PNAS..10520038C . дои : 10.1073/pnas.0807551105 . ПМК 2604982 . ПМИД 19060199 .
- ^ Мукерджи А., Вейант К.Б., Уокер Дж., Шредер К.М. (2012). «Направленная эволюция ярких мутантов кислород-независимого флавинсвязывающего флуоресцентного белка из Pseudomonas putida» . Журнал биологической инженерии . 6 (1): 20. дои : 10.1186/1754-1611-6-20 . ПМК 3488000 . ПМИД 23095243 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час Винген М., Поцкей Дж., Эндрес С., Казини Дж., Рупрехт С., Фальке С., Краусс Ю., Йегер К.Э., Дреппер Т., Генш Т. (2014). «Фотофизика флуоресцентных белков на основе LOV – новые инструменты клеточной биологии» . Фотохимия Фотобиология . 13 (6): 875–883. дои : 10.1039/c3pp50414j . ПМИД 24500379 . S2CID 6068541 .
- ^ Röllen, Katrin; Granzin, Joachim; Remeeva, Alina; Davari, Mehdi D.; Gensch, Thomas; Nazarenko, Vera V.; Kovalev, Kirill; Bogorodskiy, Andrey; Borshchevskiy, Valentin; Hemmer, Stefanie; Schwaneberg, Ulrich; Gordeliy, Valentin; Jaeger, Karl-Erich; Batra-Safferling, Renu; Gushchin, Ivan; Krauss, Ulrich (2021-04-13). "The molecular basis of spectral tuning in blue- and red-shifted flavin-binding fluorescent proteins" . The Journal of Biological Chemistry . 296 : 100662. doi : 10.1016/j.jbc.2021.100662 . ISSN 1083-351X . PMC 8131319 . PMID 33862085 .
- ^ Уитби, Л.Г. (1953). «Новый метод получения флавинадениндинуклеотида» . Биохим Дж . 54 (3): 437–442. дои : 10.1042/bj0540437 . ПМК 1269010 . ПМИД 13058921 . .
- ^ Гоедхарт Дж., фон Штеттен Д., Нуарклерк-Савой М., Лелимузен М., Йосен Л., Хинк М.А., ван Веерен Л., Гаделла Т.В., Ройант А. (2012). «Направляемая структурой эволюция голубых флуоресцентных белков к квантовому выходу 93%» . Нат Коммун . 3 : 751. Бибкод : 2012NatCo...3..751G . дои : 10.1038/ncomms1738 . ПМК 3316892 . ПМИД 22434194 .
- ^ Юнг Г., Брокхинке А., Генш Т., Хетцер Б., Шведлер С., Веттил С.К. (2012). Флуоресцентные белки I. От понимания к дизайну Том 11 . Шпрингер Берлин Гейдельберг . ISBN 978-3-642-23371-5 .
- ^ Дреппер Т., Генш Т., Пол М. (2013). «Расширенные возможности применения фоторецепторов синего света in vivo в качестве альтернативных флуоресцентных белков». Фотохимия Фотобиология . 12 (7): 1125–34. дои : 10.1039/c3pp50040c . ПМИД 23660639 . S2CID 39879469 .
- ^ Уолтер Дж., Хаусманн С., Дреппер Т., Пульс М., Эггерт Т., Дине М. (2012). «Флуоресцентные белки на основе флавинмононуклеотидов функционируют в клетках млекопитающих без потребности в кислороде» . ПЛОС ОДИН . 7 (9): е43921. Бибкод : 2012PLoSO...743921W . дои : 10.1371/journal.pone.0043921 . ПМЦ 3439463 . ПМИД 22984451 .
- ^ Поцкей Дж., Кунце М., Дреппер Т., Генш Т., Джагер К.Э., Бюхс Дж. (2012). «Определение внутриклеточного кислорода у бактерий в реальном времени с использованием генетически закодированного биосенсора на основе FRET» . БМК Биол . 10:28 . дои : 10.1186/1741-7007-10-28 . ПМЦ 3364895 . ПМИД 22439625 .
- ^ Паттерсон Дж., Дэй Р.Н., Поршень Д. (2001). «Спектры флуоресцентных белков» . J Cell Sci . 114 (Часть 5): 837–838. дои : 10.1242/jcs.114.5.837 . ПМИД 11181166 .