Рацемическая кристаллография

Рацемическая кристаллография — это метод, используемый в структурной биологии , при котором кристаллы молекулы белка образуются из эквимолярной смеси молекулы L-белка естественной хиральности и ее зеркального изображения D-белка. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Молекулы L-белка состоят из «левых» L- аминокислот и ахиральной аминокислоты глицина, тогда как молекулы D-белка в зеркальном отображении состоят из «правых» D-аминокислот и глицина. Обычно и L-белок, и D-белок получают путем полного химического синтеза.

Производство

Нативное химическое лигирование незащищенных пептидных сегментов используется для получения полипептидной цепи белка, которая затем сворачивается с образованием белковой молекулы. ^{[ 1 ]} При нативном химическом лигировании С-концевой тиоэфир пептида реагирует со вторым пептидом, имеющим остаток цистеина на N-конце, с образованием продукта с пептидной связью в месте лигирования. ^{[ 3 ]} Таким образом можно соединить несколько незащищенных пептидных сегментов с образованием полноразмерной полипептидной цепи, которая сворачивается с образованием целевой белковой молекулы. После завершения химического синтеза L-белка энантиомер D-белка можно производить с использованием синтетических пептидных строительных блоков, изготовленных из D-аминокислот и Gly. ^{[ 1 ]} Конвергентный синтез наиболее эффективен при получении длинных полипептидных цепей с использованием пептид-гидразидов, где гидразид можно превратить в тиоэфир для использования в нативном химическом лигировании. Гидразид стабилен в условиях реакции нативного химического лигирования и может быть преобразован in situ в реакционноспособный пептид-тиоэфир для следующей реакции конденсации нативного химического лигирования. ^{[ 4 ]}

Теория

Существует всего 230 различных способов расположения объектов в обычных трёхмерных массивах. В молекулярной кристаллографии такие расположения называются «пространственными группами». Однако только 65 из этих расположений доступны хиральным объектам или хиральным молекулам. Остальные 165 пространственных групп содержат либо центр симметрии, либо зеркальную плоскость и поэтому недоступны природным глобулярным белкам, представляющим собой хиральные молекулы. Вуковиц и Йейтс разработали математическую теорию, объясняющую предпочтение глобулярных белков кристаллизоваться в определенных пространственных группах. Они предположили, что предпочтительная пространственная группа определяется количеством степеней свободы (D) или размерностью как мерой легкости, с которой может быть сформирована данная симметрия. Они проанализировали количество степеней свободы как для киральных, так и для ахиральных пространственных групп, где было обнаружено, что пространственная группа P1 (бар) с D = 8 теоретически является наиболее доминирующей пространственной группой. Поскольку ахиральная пространственная группа имела более высокую степень свободы по сравнению с хиральными пространственными группами, они предсказали, что рацемические смеси энантиомеров белков будут кристаллизоваться легче по сравнению с одними природными L-белками, образуя ахиральные {L-белок плюс D-белок} пары. Хотя пространственная группа P1(bar) является наиболее предпочтительной, P21/c и C2/c также весьма предпочтительны, тогда как ожидается, что другие ахиральные пространственные группы будут появляться реже. Следовательно, P1(bar), P21/c и C2/c считаются обычными центросимметричными пространственными группами в рацемических смесях. ^{[ 1 ]}

Разработки и приложения

История

В 1989 году Алан Маккей предположил, что если можно будет использовать химический синтез для получения энантиомеров L-белка и D-белка, это позволит использовать рацемические смеси для кристаллизации белков в центросимметричных пространственных группах. Он заявил, что, поскольку в данных дифракции рентгеновских лучей, полученных от центросимметричного кристалла, недиагональные фазы будут компенсировать появление фаз, отличающихся на 180 градусов, это облегчит решение фазовой проблемы при определении структуры белка с помощью рентгеновской кристаллографии. ^{[ 4 ]}

В 1993 году Лаура Завадцке и Джереми Берг впервые использовали небольшой (45 аминокислот) белок рубредоксин для синтеза его в рацемической форме. Это было сделано, поскольку определение структуры потенциально было бы проще и надежнее при использовании данных дифракции центросимметричного кристалла , который требует роста из рацемической смеси . Наличие центра симметрии, образованного парами рацемических белков, позволит еще больше упростить этапы фазовой дифракции при анализе данных. ^{[ 5 ]} Как упоминалось выше, в 1995 году Стефани Вуковиц и Тодд Йейтс разработали математическую теорию, объясняющую, почему белковые молекулы имеют тенденцию кристаллизоваться чаще в определенных пространственных группах, чем в других; они предсказали, что наиболее предпочтительной пространственной группой белков будет P1<bar>, и предсказали, что глобулярные белки будут легче кристаллизоваться в виде рацематов из смеси рацемических белков. ^{[ 6 ]}

Известные приложения

С развитием нативного химического лигирования в 1994 году стал возможным полный химический синтез пар энантиомеров D-белка и L-белка. В первом практическом применении для решения неизвестной структуры была использована рацемическая и квазирацемическая рентгеновская кристаллография для определения структуры антифризного белка снежной блохи. В ходе этой работы было замечено, что рацемические и даже квазирацемические белковые смеси резко облегчают образование центросимметричных кристаллов дифракционного качества. Квазирацематы образуются белковыми молекулами зеркального отображения, которые не являются истинными энантиомерами, но являются достаточно похожими объектами зеркального отображения, чтобы образовывать упорядоченные псевдоцентросимметричные массивы. ^{[ 4 ]}

Впоследствии было показано, что пары рацемических и квазирацемических белковых молекул, полученные методом полного химического синтеза, значительно увеличивают вероятность успеха в формировании кристаллов дифракционного качества из широкого спектра глобулярных белковых молекул. ^{[ 7 ]}

Rv1738, белок Mycobacterium Tuberculosis, является наиболее активным генным продуктом, когда M. tb находится в состоянии постоянного покоя. Препараты рекомбинантно экспрессируемого L-белка Rv1738 сопротивлялись обширным попыткам образовать кристаллы. Рацемическая смесь химически синтезированных форм D-белка и L-белка Rv1738 дала кристаллы в центросимметричной пространственной группе C2/c. Структура, содержащая димеры L-белка и D-белка в центросимметричной пространственной группе, обнаружила структурное сходство с «факторами, способствующими спячке», которые могут связываться с рибосомами и подавлять трансляцию. ^{[ 8 ]}

Кристаллизация белка убиквитина была успешно проведена с использованием рацемической кристаллографии. Кристаллизация D-убиквитина или L-убиквитина по отдельности затруднена, тогда как рацемическая смесь D-убиквитина и L-убиквитина легко кристаллизовалась, и кристаллы дифракционного качества были получены в течение ночи почти в половине условий, проверенных в стандартном коммерческом скрининге кристаллизации. ^{[ 4 ]}

Кристаллизацией рацематов дисульфидсодержащих молекул микробелка установлена структура ингибитора трипсина SFTI-1 (14 аминокислот, 1 дисульфид), конотоксина cVc1.1 (22 аминокислоты, 2 дисульфида) и циклотида kB1 (29 аминокислот). кислоты, 3 дисульфиды). С помощью дифракции рентгеновских лучей было обнаружено, что рацематы кристаллизуются в центросимметричных пространственных группах P3(bar), Pbca и P1(bar). ^{[ 4 ]}

Интересно, что ахиральные «пептоидные» цепи складываются в рацемические пары и кристаллизуются в весьма предпочтительные центросимметричные пространственные группы.

Кристаллическая структура рацемата гетерохирального комплекса D-белка с фактором роста эндотелия сосудов А (VEGF-A) с высоким разрешением. Зеркальное изображение D-белковой формы VEGF-A использовалось в фаговом дисплее для идентификации связывающего L-белка из 56 остатков с наномолярной аффинностью; химически синтезированное связующее вещество D-белка имело такое же сродство к L-белковой форме VEGF-A. Смесь химически синтезированных белков, состоящих из D-VEGF-A, L-VEGF-A и двух эквивалентов каждого из связующего D-белка и связующего L-белка, дала рацемические кристаллы в центросимметричной пространственной группе P21/n. Структура этого гетерохирального белкового комплекса массой 71 кДа была решена с разрешением 1,6 Å. ^{[ 4 ]}

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Йейтс Т.О., Кент С.Б. (9 июня 2012 г.). «Кристаллография рацемического белка». Ежегодный обзор биофизики . 41 (1): 41–61. doi : 10.1146/annurev-biophys-050511-102333 . ПМИД 22443988 .
^ Мэтьюз BW (июнь 2009 г.). «Рацемическая кристаллография — простые кристаллы и простые структуры: что может не нравиться?» . Белковая наука . 18 (6): 1135–1138. дои : 10.1002/pro.125 . ПМЦ 2774423 . ПМИД 19472321 .
^ Агуридас В., Эль Махди О., Димер В., Каргоэт М., Монбалиу Ж.М., Мельник О. (июнь 2019 г.). «Нативное химическое лигирование и расширенные методы: механизмы, катализ, область применения и ограничения». Химические обзоры . 119 (12): 7328–7443. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00712 . ПМИД 31050890 . S2CID 145023266 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Кент СБ (октябрь 2018 г.). «Кристаллография рацемических и квазирацемических белков, обеспечиваемая химическим синтезом белка». Современное мнение в области химической биологии . Синтетическая биология / Синтетические биомолекулы. 46 : 1–9. дои : 10.1016/j.cbpa.2018.03.012 . ПМИД 29626784 . S2CID 4680759 .
^ Завадске Л.Е., Берг Дж.М. (июль 1993 г.). «Структура центросимметричного белкового кристалла». Белки . 16 (3): 301–305. дои : 10.1002/прот.340160308 . ПМИД 8346193 . S2CID 34216468 .
^ Вуковиц С.В., Йейтс Т.О. (декабрь 1995 г.). «Почему белковые кристаллы отдают предпочтение одним пространственным группам перед другими». Структурная биология природы . 2 (12): 1062–1067. дои : 10.1038/nsb1295-1062 . ПМИД 8846217 . S2CID 22994029 .
^ Ян Б, Е Л, Сюй В, Лю Л (сентябрь 2017 г.). «Последние достижения в кристаллографии рацемических белков». Биоорганическая и медицинская химия . Связывание пептидов и белков. 25 (18): 4953–4965. дои : 10.1016/j.bmc.2017.05.020 . ПМИД 28705433 .
^ Банкер Р.Д., Мандал К., Башири Г., Честон Дж.Дж., Пентелют Б.Л., Лотт Дж.С. и др. (апрель 2015 г.). «Функциональная роль Rv1738 в персистенции микобактерий туберкулеза, подтвержденная кристаллографией рацемических белков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 112 (14): 4310–4315. дои : 10.1073/pnas.1422387112 . ПМЦ 4394262 . ПМИД 25831534 .

[:02-1] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Йейтс Т.О., Кент С.Б. (9 июня 2012 г.). «Кристаллография рацемического белка». Ежегодный обзор биофизики . 41 (1): 41–61. doi : 10.1146/annurev-biophys-050511-102333 . ПМИД 22443988 .

[2] Мэтьюз BW (июнь 2009 г.). «Рацемическая кристаллография — простые кристаллы и простые структуры: что может не нравиться?» . Белковая наука . 18 (6): 1135–1138. дои : 10.1002/pro.125 . ПМЦ 2774423 . ПМИД 19472321 .

[3] Агуридас В., Эль Махди О., Димер В., Каргоэт М., Монбалиу Ж.М., Мельник О. (июнь 2019 г.). «Нативное химическое лигирование и расширенные методы: механизмы, катализ, область применения и ограничения». Химические обзоры . 119 (12): 7328–7443. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00712 . ПМИД 31050890 . S2CID 145023266 .

[:1-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Кент СБ (октябрь 2018 г.). «Кристаллография рацемических и квазирацемических белков, обеспечиваемая химическим синтезом белка». Современное мнение в области химической биологии . Синтетическая биология / Синтетические биомолекулы. 46 : 1–9. дои : 10.1016/j.cbpa.2018.03.012 . ПМИД 29626784 . S2CID 4680759 .

[5] Завадске Л.Е., Берг Дж.М. (июль 1993 г.). «Структура центросимметричного белкового кристалла». Белки . 16 (3): 301–305. дои : 10.1002/прот.340160308 . ПМИД 8346193 . S2CID 34216468 .

[6] Вуковиц С.В., Йейтс Т.О. (декабрь 1995 г.). «Почему белковые кристаллы отдают предпочтение одним пространственным группам перед другими». Структурная биология природы . 2 (12): 1062–1067. дои : 10.1038/nsb1295-1062 . ПМИД 8846217 . S2CID 22994029 .

[7] Ян Б, Е Л, Сюй В, Лю Л (сентябрь 2017 г.). «Последние достижения в кристаллографии рацемических белков». Биоорганическая и медицинская химия . Связывание пептидов и белков. 25 (18): 4953–4965. дои : 10.1016/j.bmc.2017.05.020 . ПМИД 28705433 .

[8] Банкер Р.Д., Мандал К., Башири Г., Честон Дж.Дж., Пентелют Б.Л., Лотт Дж.С. и др. (апрель 2015 г.). «Функциональная роль Rv1738 в персистенции микобактерий туберкулеза, подтвержденная кристаллографией рацемических белков» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 112 (14): 4310–4315. дои : 10.1073/pnas.1422387112 . ПМЦ 4394262 . ПМИД 25831534 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]