Тестирование мышц in vitro

in vitro Мышечное тестирование — это метод, используемый для характеристики свойств живой мышечной ткани после ее удаления из организма, который позволяет более обширно и точно определить ее свойства, чем тестирование in vivo . Тестирование мышц in vitro позволило получить большую часть научных знаний о структуре и физиологии мышц, а также о том, как они связаны с работоспособностью организма. Исследования стволовых клеток основаны на тестировании мышц in vitro для установления функции отдельных мышечных клеток и их индивидуального поведения отдельно от мышечных клеток в присутствии немышечных клеток, наблюдаемых в исследованиях in vitro . ^[1]

Изоляция ткани

После того, как выбрано подходящее животное — будь то лягушка для прыжков с определенной двигательной функцией; или конкретный штамм животного, чтобы ответить на вопрос исследования: конкретная мышца идентифицируется на основе ее функции in vivo и распределения типов волокон. После этического одобрения и, при необходимости, одобрения правительства животное подвергается гуманной эвтаназии. Гуманные методы различаются в зависимости от страны, наиболее подходящий основан на этическом одобрении и уровне квалификации исследователя. Чтобы гарантировать полную смерть животного без возможности выздоровления, необходимо соблюдать ряд дополнительных критериев, которые включают прекращение кровотока путем удаления сердца из системы кровообращения и/или полное разрушение головного и спинного мозга. После этого обычно быстро получают общие показатели морфологии животных, такие как длина животного, масса тела и другие биомеханические маркеры, которые могут иметь важное значение. Затем животное готовят к сбору целевой мышцы. В изолированных мышцах это, как правило, мышцы задних конечностей, например камбаловидная мышца или EDL млекопитающих, или подошвенная или подвздошно-большеберцовая мышца амфибий. Другие мышцы, которые были исследованы in vitro, включают диафрагму и сосочковые мышцы .

Для успешной изоляции скелетных мышц необходимы определенные условия. Ткань следует изолировать в часто меняющемся охлажденном растворе Рингера или растворе Кребса-Хенселейта, чтобы обеспечить замедление метаболических условий (следовательно, требуется охлажденная среда для рассечения), а также предотвратить гибель ткани из-за отсутствия субстратов в среде, следовательно, необходимость частого изменения решений. Рассекающий раствор должен постоянно насыщаться кислородом и углекислым газом в концентрации, соответствующей подготавливаемой ткани. Обычно ткани немлекопитающих готовят в газообразном растворе, барботированном 98% кислорода, 2% диоксида углерода, тогда как ткани млекопитающих в растворе, барботированном 95% кислорода, 5% диоксида углерода. Микроскоп с соответствующим уровнем увеличения требуется из-за ловкости, необходимой для изоляции мышц. Внешний оптоволоконный источник света также полезен, поскольку обеспечивает достаточное освещение без выделения тепла.

Не существует правильного подхода к подготовке мышц к тестированию, пока мышца не повреждена во время подготовки, мышечно-сухожильный блок цел и есть что-то, что можно использовать для закрепления мышцы внутри испытательного стенда. Кусочки кости можно оставить на проксимальном и/или дистальном конце скелетных мышц для обеспечения фиксации. Кроме того, можно использовать шелковые нити или зажимы из алюминиевой Т-образной фольги для обертывания сухожилия мышцы, чтобы обеспечить как поддержку сухожилия, так и использовать его для фиксации в механическом снаряжении.

Оборудование

Для тестирования мышц in vitro обычно требуется двухрежимный серводвигатель, который может как контролировать, так и обнаруживать изменения силы и длины. Если двухрежимная система недоступна, можно использовать независимый датчик силы и рычаг двигателя. Один конец образца ткани фиксируется на месте с помощью иглы, если он зашит, или зажима «крокодил», если он подготовлен с помощью зажимов из алюминиевой Т-образной фольги, а другой конец прикрепляется к серводвигателю. Вся мышца омывается раствором Рингера или раствором Кребса-Хенселейта с барботированием кислорода, чтобы сохранить ткань живой и метаболически активной. Раствор нагревают, обычно с помощью внешнего нагревателя/охладителя водяной бани, до температуры, соответствующей тестируемой мышце. Мышцы стимулируются к сокращению путем подачи электрического тока либо к нерву, который иннервирует мышцу, либо через платиновые электроды, помещенные в циркулирующий раствор, чтобы вызвать реакцию всей мышцы. Серводвигатель обнаруживает изменения силы и/или длины из-за сокращение мышц . Уровень стимуляции часто устанавливается на уровне, обеспечивающем максимальное вовлечение двигательных единиц . Серводвигатель можно запрограммировать на поддержание заданной силы, позволяя мышце изменять длину и наоборот, или мышца может подвергаться более сложному тестированию, например, в рабочих циклах . При перистых мышц использовании часто используется сономометрия для точного определения длины волокон во время теста.

Шкала

Тестирование мышц in vitro можно проводить в любом масштабе мышечной организации: целые группы мышц (при условии, что они имеют общее прикрепление или начало, как в четырехглавой мышце человека), отдельная мышца, «пучок» мышечных волокон , отдельная мышца. волокно, отдельная миофибрилла, одиночный саркомер , кардиомиоцит или даже полусаркомер. Мышечные волокна могут быть неповрежденными или могут иметь «оболочку» — процесс, при котором удаляются клеточная мембрана, саркоплазматический ретикулум и цитоплазма, обеспечивая больший доступ к сократительным компонентам саркомера.

Типичные тесты

Обычно проверяются несколько свойств, и в данном эксперименте часто используется подмножество этих свойств, включая время сокращения, тетаническую силу, соотношение силы и длины, соотношение силы и скорости, рабочие циклы , усталостные испытания, частоту синтеза и энергетические затраты.

На месте

гибридный подход in vitro и in vivo Недавно был использован , называемый in situ , при котором организм подвергается терминальной анестезии, а тесты in vivo проводятся с мышцами, все еще прикрепленными к организму. Это гарантирует, что мышцы поддерживают правильную температуру и в достаточном количестве снабжаются питательными веществами и кислородом из крови, но процедура более сложна, и некоторые тесты могут оказаться невозможными. ^[2]

Разновидность

Тестирование мышц in vitro у людей почти никогда не проводится, за исключением небольших участков мышц, удаленных с помощью биопсии или во время хирургического вмешательства по поводу других заболеваний. Тестирование у млекопитающих и птиц обычно сложнее из-за высокой температуры и потребности мышц в кислороде, что приводит к быстрой гибели клеток после удаления мышечной ткани из организма. Скелетные мышцы млекопитающих обычно тестируются при температуре ~25°C, чтобы продлить протокол испытаний как можно дольше. Тестовую температуру ~37°C также можно использовать при тестировании целых изолированных скелетных мышц млекопитающих, чтобы лучше воспроизвести температуру, обнаруженную in vivo . Кроме того, важно учитывать термическую специализацию скелетных мышц, поскольку мышцы кора более восприимчивы к изменениям механических характеристик при небольших изменениях температуры, чем периферические мышцы. ^[3] У эктотермных животных (рептилий, амфибий, рыб и беспозвоночных) мышечная ткань может сохраняться вне организма в течение нескольких часов и даже дней в зависимости от температуры и организма. Многие эксперименты проводятся при температуре 0°C или около нее, чтобы продлить срок службы мышцы. Кроме того, у рыб и амфибий можно выделить одно мышечное волокно, сохранив его нетронутым, но у других видов это обычно невозможно.

Преимущества изолированного мышечного тестирования

Выделение мышечной ткани in vitro позволяет получить отдельные данные о функции мышечных клеток без присутствия поблизости сигнальных немышечных клеток. ^[1] Тестирование in vitro позволяет точно стимулировать мышцы, предоставляя точные данные о врожденном поведении тканей. ^[4] Тестирование изолированных мышц ограничивает влияние других факторов на окружающую среду вокруг ткани, таких как субстраты. Тестирование изолированных мышц in vitro — полезная процедура, основанная на ее идеальной точности, прецизионности и воспроизводимости. ^[5]

Недостатки изолированного мышечного тестирования

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Блау Х.М., Вебстер С. (сентябрь 1981 г.). «Выделение и характеристика мышечных клеток человека» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 78 (9): 5623–5627. Бибкод : 1981PNAS...78.5623B . дои : 10.1073/pnas.78.9.5623 . ПМЦ 348807 . ПМИД 6946499 .
^ aursc20dev (08.11.2012). «Преимущества тестирования мышечной механики in-situ или in-vivo» . Аврора Сайентифик . Проверено 27 июня 2023 г. {{cite web}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
^ Джеймс Р.С., Таллис Дж., Анджилетта М.Дж. (январь 2015 г.). «Региональная термическая специализация млекопитающих: температура влияет на выходную мощность основных мышц больше, чем на периферические мышцы у взрослых мышей (Mus musculus)» (PDF) . Журнал сравнительной физиологии B: Биохимическая, системная и физиология окружающей среды . 185 (1): 135–142. дои : 10.1007/s00360-014-0872-6 . ПМИД 25403362 . S2CID 17011933 .
^ Смит Л.Р., Мейер Г.А. (2020). «Эксплантаты скелетных мышц: модели ex-vivo для изучения поведения клеток в сложной тканевой среде» . Исследование соединительной ткани . 61 (3–4): 248–261. дои : 10.1080/03008207.2019.1662409 . ПМЦ 8837600 . ПМИД 31492079 .
^ Дессаж Ф., Шледер С., Перручо М.Х., Руже К. (май 2021 г.). «3D-модели скелетных мышц in vitro: миопсфера, миопучок и биопечатная мышечная конструкция» . Ветеринарное исследование . 52 (1): 72. дои : 10.1186/s13567-021-00942-w . ПМЦ 8136231 . ПМИД 34011392 .

[:0-1] Jump up to: ^а ^б Блау Х.М., Вебстер С. (сентябрь 1981 г.). «Выделение и характеристика мышечных клеток человека» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 78 (9): 5623–5627. Бибкод : 1981PNAS...78.5623B . дои : 10.1073/pnas.78.9.5623 . ПМЦ 348807 . ПМИД 6946499 .

[2] ursc20dev (08.11.2012). «Преимущества тестирования мышечной механики in-situ или in-vivo» . Аврора Сайентифик . Проверено 27 июня 2023 г. {{cite web}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )

[3] Джеймс Р.С., Таллис Дж., Анджилетта М.Дж. (январь 2015 г.). «Региональная термическая специализация млекопитающих: температура влияет на выходную мощность основных мышц больше, чем на периферические мышцы у взрослых мышей (Mus musculus)» (PDF) . Журнал сравнительной физиологии B: Биохимическая, системная и физиология окружающей среды . 185 (1): 135–142. дои : 10.1007/s00360-014-0872-6 . ПМИД 25403362 . S2CID 17011933 .

[4] Смит Л.Р., Мейер Г.А. (2020). «Эксплантаты скелетных мышц: модели ex-vivo для изучения поведения клеток в сложной тканевой среде» . Исследование соединительной ткани . 61 (3–4): 248–261. дои : 10.1080/03008207.2019.1662409 . ПМЦ 8837600 . ПМИД 31492079 .

[5] Дессаж Ф., Шледер С., Перручо М.Х., Руже К. (май 2021 г.). «3D-модели скелетных мышц in vitro: миопсфера, миопучок и биопечатная мышечная конструкция» . Ветеринарное исследование . 52 (1): 72. дои : 10.1186/s13567-021-00942-w . ПМЦ 8136231 . ПМИД 34011392 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]