Биотехнологии в фармацевтическом производстве
Биотехнология – это использование живых организмов для разработки полезных продуктов. Биотехнологии часто используются в фармацевтическом производстве . Яркие примеры включают использование бактерий для производства таких веществ, как инсулин или гормон роста человека. Другие примеры включают использование трансгенных свиней для создания гемоглобина, используемого людьми.
Человеческий инсулин
[ редактировать ]
Одним из первых применений биотехнологии в фармацевтическом производстве является использование технологии рекомбинантной ДНК для модификации бактерий Escherichia coli для производства человеческого инсулина , которое было выполнено в Genentech в 1978 году. [1] До разработки этого метода инсулин экстрагировали из поджелудочной железы крупного рогатого скота, свиней и других сельскохозяйственных животных. Хотя инсулин животного происхождения в целом эффективен при лечении диабета , он неотличим от человеческого инсулина и поэтому может вызывать аллергические реакции. [2] Исследователи Genentech создали искусственные гены для каждой из двух белковых цепей, составляющих молекулу инсулина. Искусственные гены «затем были вставлены... в плазмиды... в группу генов, которые» [1] активируются лактозой . Таким образом, гены, продуцирующие инсулин, также активировались лактозой. Рекомбинантные плазмиды были вставлены в бактерии Escherichia coli , которые «были вынуждены производить 100 000 молекул человеческого инсулина либо цепи A, либо цепи B». [1] Затем две белковые цепи были объединены для получения молекул инсулина.
Гормон роста человека
[ редактировать ]
До использования технологии рекомбинантной ДНК для модификации бактерий с целью производства гормона роста человека этот гормон производился путем экстракции из гипофизов трупов, поскольку гормоны роста животных не имеют терапевтической ценности для человека. Для производства годового запаса человеческого гормона роста требовалось до пятидесяти гипофизов. [3] создавая значительный дефицит гормона. [4] В 1979 году ученые из Genentech произвели гормон роста человека, вставив ДНК, кодирующую гормон роста человека, в плазмиду, имплантированную в Escherichia coli бактерии . Ген, который был встроен в плазмиду, был создан путем обратной транскрипции мРНК, обнаруженной в гипофизе, в комплементарную ДНК. HaeIII, тип фермента рестрикции, который действует в сайтах рестрикции «в 3'-некодирующей области». [5] и 23-й кодон в комплементарной ДНК для гормона роста человека использовался для получения «фрагмента ДНК из 551 пары оснований, который включает кодирующие последовательности аминокислот 24–191 гормона роста». [5] Затем «химически синтезированный «адаптерный» фрагмент ДНК, содержащий инициирующий кодон ATG…» [5] был произведен с использованием кодонов с первой по 23-ю аминокислот гормона роста человека. «Два фрагмента ДНК... [были] объединены, чтобы сформировать синтетическо-природный «гибридный» ген». [5] Использование полностью синтетических методов производства ДНК для получения гена, который будет транслироваться в гормон роста человека в Escherichia coli, было бы чрезвычайно трудоемким из-за значительной длины аминокислотной последовательности в гормоне роста человека. Однако если бы кДНК, обратно транскрибированная с мРНК человеческого гормона роста, была бы вставлена непосредственно в плазмиду, введенную в Escherichia coli, бактерии транслировали бы области гена, которые не транслируются у человека, тем самым производя «прегормон, содержащий дополнительные 26 аминокислот» [5] которые, возможно, будет сложно удалить.
Факторы свертывания крови человека
[ редактировать ]До разработки и одобрения FDA средств для производства факторов свертывания крови человека с использованием технологий рекомбинантной ДНК, факторы свертывания крови человека производились из донорской крови, которая не была должным образом проверена на ВИЧ . Таким образом, ВИЧ-инфекция представляла значительную опасность для больных гемофилией , получавших человеческие факторы свертывания крови:
В большинстве отчетов указывается, что от 60 до 80 процентов пациентов с гемофилией, подвергшихся воздействию концентратов фактора VIII в период с 1979 по 1984 год, являются серопозитивными к ВИЧ по данным вестерн-блоттинга. По состоянию на май 1988 года более 659 больных гемофилией болели СПИДом... [6]
Первым фактором свертывания крови человека, который был произведен в значительных количествах с использованием технологии рекомбинантной ДНК, был фактор IX , который был получен с использованием трансгенных клеток яичника китайского хомячка в 1986 году. [7] Не имея карты генома человека, исследователи получили известную последовательность РНК фактора IX, исследуя аминокислоты фактора IX:
Микросеквенирование высокоочищенного... [Фактора IX] позволило получить достаточную аминокислотную последовательность для создания олигонуклеотидных зондов. [8]
Известную последовательность РНК фактора IX затем использовали для поиска гена, кодирующего фактор IX, в библиотеке ДНК, обнаруженной в печени человека, поскольку было известно, что факторы свертывания крови продуцируются печенью человека: [8]
Был синтезирован и помечен уникальный олигонуклеотид... гомологичный мРНК фактора IX... Полученный зонд был использован для скрининга библиотеки двухцепочечной кДНК печени человека... Полные последовательности двухцепочечной ДНК... [соответствующая] кДНК... содержала всю СООН-концевую кодирующую последовательность одиннадцатого кодона (11) и всю 3'-нетранслируемую последовательность. [7]
Эту последовательность кДНК использовали для поиска остальных последовательностей ДНК, содержащих ген фактора IX, путем поиска ДНК в Х-хромосоме:
Была подготовлена геномная библиотека из ХХХХ хромосомы человека... и подвергнута скринингу с помощью зонда кДНК фактора IX. Гибридизирующийся рекомбинантный фаг выделяли, очищали бляшками и выделяли ДНК. Рестрикционное картирование, Саузерн-анализ и секвенирование ДНК позволили идентифицировать пять вставок, содержащих рекомбинантный фаг, которые при перекрытии общих последовательностей кодировали весь ген фактора IX размером 35 т.п.н. [9]
Плазмиды, содержащие ген фактора IX, а также плазмиды с геном, кодирующим устойчивость к метотрексату, были вставлены в клетки яичника китайского хомячка посредством трансфекции. Трансфекция предполагает вставку ДНК в эукариотическую клетку. В отличие от аналогичного процесса трансформации у бактерий, трансфицированная ДНК обычно не интегрируется в геном клетки и поэтому обычно не передается последующим поколениям посредством клеточного деления. Таким образом, чтобы получить «стабильную» трансфекцию, необходимо также трансфицировать ген, который обеспечивает значительное преимущество в выживании, в результате чего те немногие клетки, которые интегрировали трансфицированную ДНК в свои геномы, увеличивают свою популяцию как клетки, которые не интегрировали ДНК. устранены. В случае данного исследования «рост [th] при увеличении концентрации метотрексата» [10] способствовал выживанию стабильно трансфицированных клеток и уменьшал выживаемость других клеток.
Стабильно трансфицированные клетки яичников китайского хомячка продуцировали значительные количества фактора IX, который, как было показано, обладает значительными коагулянтными свойствами, хотя и в меньшей степени, чем фактор IX, вырабатываемый из крови человека:
Удельную активность рекомбинантного фактора IX измеряли на основе прямого измерения активности коагулянта... Удельная активность рекомбинантного фактора IX составляла 75 единиц/мг... по сравнению со 150 единицами/мг, измеренными для фактора, полученного из плазмы. IX... [11]
В 1992 году FDA одобрило фактор VIII, полученный с использованием трансгенных клеток яичника китайского хомячка, и это был первый одобренный фактор свертывания крови, полученный с использованием технологии рекомбинантной ДНК. [12]
Трансгенные сельскохозяйственные животные
[ редактировать ]
Методы рекомбинантной ДНК также использовались для создания трансгенных сельскохозяйственных животных, которые могут производить фармацевтические продукты для использования на людях. Например, созданы свиньи, производящие человеческий гемоглобин. Хотя кровь таких свиней нельзя было использовать непосредственно для переливания человеку, гемоглобин можно было очистить и использовать для производства заменителя крови. [13]
Паклитаксел (Таксол)
[ редактировать ]Компания Bristol-Myers Squibb производит паклитаксел, используя Penicillium raistrickii и ферментацию растительных клеток (PCF). [ нужна ссылка ]
Артемизинин
[ редактировать ]Трансгенные дрожжи используются для производства артемизинина , а также ряда аналогов инсулина . [14]
См. также
[ редактировать ]- Молекулярная биотехнология (журнал)
- бацилл Изоляты
- Грибковые изоляты
- Лекарственные формы
- Губка изолирует
- стрептомицетов Изоляты
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с «Человеческий инсулин: захват золотой плазмиды». Новости науки . 114 (12): 195–196. 16 сентября 1978 г. дои : 10.2307/3963132 . JSTOR 3963132 .
- ^ Брар, Deepinder: «История инсулина» http://www.med.uni-giessen.de/itr/history/inshist.html. Архивировано 1 ноября 2018 г. на Wayback Machine , по состоянию на 14 июня 2006 г.
- ^ «Лабораторная связь с гормоном роста человека». Новости науки . 116 (2): 22. 14 июля 1979 г. дои : 10.2307/3964172 . JSTOR 3964172 .
- ^ Уолгейт Р. (март 1981 г.). «Гипофизарный спад» . Природа . 290 (5801): 6–7 nbgcyt5. дои : 10.1038/290006b0 . ПМИД 7207586 .
- ^ Jump up to: а б с д и Гёддель Д.В., Хейнекер Х.Л., Ходзуми Т. и др. (октябрь 1979 г.). «Прямая экспрессия в Escherichia coli последовательности ДНК, кодирующей гормон роста человека». Природа . 281 (5732): 544–8. Бибкод : 1979Natur.281..544G . дои : 10.1038/281544a0 . ПМИД 386136 . S2CID 4237998 .
- ^ Уайт GC, Макмиллан CW, Кингдон HS, Шумейкер CB (январь 1989 г.). «Использование рекомбинантного антигемофильного фактора в лечении двух больных классической гемофилией». Н. англ. Дж. Мед . 320 (3): 166–70. дои : 10.1056/NEJM198901193200307 . ПМИД 2492083 .
- ^ Jump up to: а б Кауфман Р.Дж., Уэсли Л.К., Фьюри BC, Фьюри Б., Шумейкер CB (июль 1986 г.). «Экспрессия, очистка и характеристика рекомбинантного гамма-карбоксилированного фактора IX, синтезированного в клетках яичника китайского хомячка» . Ж. Биол. Хим . 261 (21): 9622–8. дои : 10.1016/S0021-9258(18)67559-3 . ПМИД 3733688 .
- ^ Jump up to: а б Тул Дж.Дж., Кнопф Дж.Л., Возни Дж.М. и др. (1984). «Молекулярное клонирование кДНК, кодирующей антигемофильный фактор человека». Природа . 312 (5992): 342–7. Бибкод : 1984Natur.312..342T . дои : 10.1038/312342a0 . ПМИД 6438528 . S2CID 4313575 .
страница 343
- ^ Кауфман, страницы 9622–3.
- ^ Кауфман, страница 9623.
- ^ Кауфман, страница 9626.
- ^ Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США: «Лицензирование первого фактора свертывания крови, полученного из рекомбинантной ДНК», https://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00312.html , по состоянию на 17 июня 2006 г.
- ^ О'Доннелл Дж. К., Мартин М. Дж., Логан Дж. С., Кумар Р. (1993). «Производство человеческого гемоглобина у трансгенных свиней: подход к кровезаменителю». Обнаружение рака. Пред . 17 (2): 307–12. ПМИД 8402717 .
- ^ Марк Пеплоу. «Санофи запускает производство лекарств от малярии | Мир химии» . Rsc.org . Проверено 17 декабря 2013 г.