Гибридизация колоний

Гибридизация колоний — это метод отбора бактериальных колоний с нужными генами посредством прямого процесса клонирования и переноса. ^[1] Интересующие гены были добавлены к бактериальной плазмиде ранее посредством рекомбинации , что позволяет анализировать гены других организмов в бактериальной колонии. Весь процесс включает в себя перенос генетического материала из одной среды в другую, обычно с использованием нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги, с целью идентификации и выделения конкретного гена. Рентгенограмма РНК используется для обнаружения желаемой последовательности в новой бактериальной колонии и, по сути, «осветляет ее», чтобы последовательность можно было идентифицировать для переноса. Наиболее распространенной целью гибридизации колоний является проверка того, что определенная последовательность ДНК смогла успешно проникнуть в новую клетку, а это означает, что клетки, анализируемые с помощью этого метода, являются результатом рекомбинации между определенным фрагментом ДНК и бактериальной плазмидой. ^[2] Этот метод был открыт Майклом Грунштейном и Дэвидом С. Хогнессом . ^[3]

Методы

Гибридизация колоний начинается с желания извлечь сегмент ДНК, содержащий определенный ген, например ген, передающий устойчивость к антибиотикам. ^[4] Определенный фрагмент ДНК удаляется из соответствующей клеточной культуры и вставляется в бактериальную плазмиду посредством процесса, известного как рекомбинация. Эти бактериальные плазмиды культивируют на чашках с питательным агаром, что приводит к образованию бактериальных колоний, некоторые из которых в идеале продолжают содержать интересующий ген. Затем нитроцеллюлозный фильтр трижды промывают дистиллированной водой, помещают между абсорбирующими листами и нагревают при высоких температурах, чтобы убить бактерии или другие микроорганизмы. Этот фильтр с размером пор 0,45 мкм подвергается этим процессам, чтобы гарантировать отсутствие загрязнений во время передачи, что обеспечивает точность результатов. Затем бактериальные колонии симметрично реплицируются на нитроцеллюлозный фильтр путем прямого контакта. На этом этапе клетки на мембране фильтра лизируются, чтобы открыть плазмиды для облегчения доступа, а их ДНК денатурируется, что позволяет ей связываться с фильтром. ^[2] Эти кластеры ДНК затем гибридизуются с желаемой радиоактивно меченной РНК или ДНК- зондом и подвергаются скринингу авторадиографии . Зонд РНК (или ДНК) специально выбирался заранее на основе ДНК, несущей нужный ген, поскольку зонд должен содержать комплементарную цепь, которая позволит ему точно связываться с правильным генетическим материалом. С помощью радиоактивного зонда идентифицируются кластеры, в которых обнаружен нужный ген, для использования в дальнейших исследованиях. Часто их затем сопоставляют с соответствующими (живыми) бактериальными колониями, не прошедшими процедуру лизиса клеток, которые также можно изолировать для дальнейшего роста и экспериментов. ^[3]

История

Первоначальное открытие этого метода использовало сегменты ДНК Drosophila melanogaster в качестве генетического материала выбора, который был помещен в плазмиду E. Coli . Цель, описанная в публикации 1975 года Майклом Грунштейном и Дэвидом С. Хогнессом, ссылается на предыдущую неспособность выделить конкретную желаемую последовательность из гибридизированной клетки, что побуждает их предпринять шаги, чтобы сделать это возможным. ^[3] Они пришли к выводу, что разработанный ими метод, который будет называться гибридизацией колоний, подходит для выделения любого сегмента ДНК, при условии, что доступна правильная комплементарная РНК для идентификации выбранной последовательности.

Несколько лет спустя, в 1978 году, Бриджит Ками и Филипп Курильский провели дальнейшие эксперименты, чтобы повысить эффективность гибридизации колоний, в частности, за счет увеличения количества бактериальных колоний на чашку. В разработанной ими процедуре использовался профаг, который индуцировали термически, чтобы лизировать все клетки на планшете. Разработав этот метод, Ками и Курильский ускорили процесс гибридизации колоний и предотвратили необходимость гибридизации каждой колонии индивидуально, что имело место в самых ранних процедурах. ^[5]

Обычное использование

Существует бесчисленное множество вариантов применения методов гибридизации колоний, но есть несколько публикаций последних лет, в которых подчеркивается использование этого процесса нетрадиционными способами. В 2006 году Департамент микробиологии и иммунологии Британской Колумбии опубликовал статью, в которой подробно описывается использование гибридизации колоний как формы очистки сточных вод. Целью экспериментальной процедуры было решить, подходит ли этот процесс для точного скрининга конкретных образцов ДНК в сточных водах, поскольку существует значительное количество колоний, которые можно проверять одновременно. ^[6] Также существует множество различных методов гибридизации ДНК, используемых при анализе инфекционных заболеваний. N. gonorrhoeae и C. trachomatis , рекомендовали для анализа с помощью методов гибридизации колоний — это две разные хорошо известные болезни, которые национальные организации здравоохранения, включая Центры по контролю заболеваний . Это всего лишь несколько конкретных примеров, подробно описывающих, как гибридизация колоний может использоваться в различных научных областях и для самых разных целей. ^[4]

Ссылки

^ Редей GP (16 июля 2016 г.). Энциклопедия генетики, геномики, протеомики и информатики . Спрингер Нидерланды. п. 392. дои : 10.1007/978-1-4020-6754-9 . ISBN 978-1-4020-6754-9 .
^ Jump up to: ^а ^б Суприя Н (25 марта 2019 г.). «Что такое гибридизация колоний? Определение, переносящая среда и процесс» . Читатель по биологии . Проверено 30 апреля 2022 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с Грунштейн М., Хогнесс Д.С. (октябрь 1975 г.). «Гибридизация колоний: метод выделения клонированных ДНК, содержащих определенный ген» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (10): 3961–3965. Бибкод : 1975PNAS...72.3961G . дои : 10.1073/pnas.72.10.3961 . ПМК 433117 . ПМИД 1105573 .
^ Jump up to: ^а ^б Теновер (июнь 1993 г.). «Методы гибридизации ДНК и их применение для диагностики инфекционных заболеваний». Клиники инфекционных заболеваний Северной Америки . 7 (2): 171–181. дои : 10.1016/S0891-5520(20)30517-1 . ПМИД 8345164 .
^ Ками Б., Курильский П. (июль 1978 г.). «Скрининг клонированной рекомбинантной ДНК бактерий методом гибридизации колоний in situ» . Исследования нуклеиновых кислот . 5 (7): 2381–2390. дои : 10.1093/нар/5.7.2381 . ПМК 342171 . ПМИД 353741 .
^ Ву В, Чжан Х.Х., Уэлш М.Дж., Кауфман П.Г. (2011). «Характеристика ДНК или генов с помощью Саузерн-блот-гибридизации» . Генная биотехнология (3-е изд.). ЦРК Пресс. стр. 185–210. дои : 10.1201/b10919-10 . ISBN 978-0-429-16573-3 . Проверено 30 апреля 2022 г.

[1] Редей GP (16 июля 2016 г.). Энциклопедия генетики, геномики, протеомики и информатики . Спрингер Нидерланды. п. 392. дои : 10.1007/978-1-4020-6754-9 . ISBN 978-1-4020-6754-9 .

[:0-2] Jump up to: ^а ^б Суприя Н (25 марта 2019 г.). «Что такое гибридизация колоний? Определение, переносящая среда и процесс» . Читатель по биологии . Проверено 30 апреля 2022 г.

[original-3] Jump up to: ^а ^б ^с Грунштейн М., Хогнесс Д.С. (октябрь 1975 г.). «Гибридизация колоний: метод выделения клонированных ДНК, содержащих определенный ген» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 72 (10): 3961–3965. Бибкод : 1975PNAS...72.3961G . дои : 10.1073/pnas.72.10.3961 . ПМК 433117 . ПМИД 1105573 .

[:1-4] Jump up to: ^а ^б Теновер (июнь 1993 г.). «Методы гибридизации ДНК и их применение для диагностики инфекционных заболеваний». Клиники инфекционных заболеваний Северной Америки . 7 (2): 171–181. дои : 10.1016/S0891-5520(20)30517-1 . ПМИД 8345164 .

[5] Ками Б., Курильский П. (июль 1978 г.). «Скрининг клонированной рекомбинантной ДНК бактерий методом гибридизации колоний in situ» . Исследования нуклеиновых кислот . 5 (7): 2381–2390. дои : 10.1093/нар/5.7.2381 . ПМК 342171 . ПМИД 353741 .

[6] Ву В, Чжан Х.Х., Уэлш М.Дж., Кауфман П.Г. (2011). «Характеристика ДНК или генов с помощью Саузерн-блот-гибридизации» . Генная биотехнология (3-е изд.). ЦРК Пресс. стр. 185–210. дои : 10.1201/b10919-10 . ISBN 978-0-429-16573-3 . Проверено 30 апреля 2022 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]