Аланиновое сканирование
В молекулярной биологии аланиновое сканирование — это метод сайт-направленного мутагенеза, используемый для определения вклада конкретного остатка в стабильность или функцию данного белка. [ 1 ] Аланин используется из-за его небольшой, химически инертной метильной функциональной группы, которая, тем не менее, имитирует предпочтения вторичной структуры , которыми обладают многие другие аминокислоты. Иногда объемистые аминокислоты, такие как валин или лейцин, используются в тех случаях, когда необходимо сохранение размера мутированных остатков.
Этот метод также можно использовать для определения того, играет ли боковая цепь конкретного остатка значительную роль в биологической активности . Обычно это достигается путем сайт-направленного мутагенеза или случайным образом путем создания ПЦР библиотеки . Кроме того, были разработаны вычислительные методы оценки термодинамических параметров на основе теоретических аланиновых замещений.
Этот метод является быстрым, поскольку одновременно анализируется множество боковых цепей и отпадает необходимость в очистке белка и биофизическом анализе. [ 2 ] На данный момент эта технология очень зрелая и широко используется в биохимических областях. Данные могут быть проверены с помощью ИК- , ЯМР-спектроскопии , математических методов, биоанализов и т. д. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]
Одним из хороших примеров сканирования аланина является изучение роли заряженных остатков на поверхности белков. [ 6 ] В систематическом исследовании роли консервативных заряженных остатков на поверхности эпителиального натриевого канала ( ENaC ) аланиновое сканирование использовалось, чтобы выявить важность заряженных остатков для процесса транспорта белков на поверхность клетки. [ 6 ]
Приложения
[ редактировать ]Сканирование аланина использовалось для одновременного определения функционального вклада 19 боковых цепей, скрытых на границе раздела между гормоном роста человека и внеклеточным доменом его рецептора. [ 2 ] Каждая аминокислота в боковых цепях была заменена аланином. Затем был использован метод дробового сканирования, который сочетает в себе концепции аланинового сканирующего мутагенеза и биномиального мутагенеза с технологией фагового дисплея.
Другим важным применением сканирования аланина является определение влияния отдельных остатков на структуру и активность прототипа циклотида калата B1. [ 3 ] Циклотиды обладают широким спектром фармацевтически важной биологической активности, но их естественная функция заключается в защите растений в качестве инсектицидных средств. В структуре циклотид калата В1 все 23 нецистеиновых остатка последовательно замещены аланином. Данные были проверены методом ЯМР-спектроскопии .
Кроме того, аланиновое сканирование также используется для определения того, какой функциональный мотив Cry4Aa обладает комарицидной активностью. [ 4 ] Cry4Aa был произведен Bacillus thuringiensis . Это токсин, специфичный для двукрылых, и он играет важную роль в производстве биоинсектицидов для борьбы с комарами. Поэтому очень важно определить, какой функциональный мотив Cry4Aa способствует этой активности. В этом исследовании несколько мутантов Cry4Aa были созданы путем замены остатков потенциального сайта связывания рецептора, петель 1, 2 и 3 в домене II, на аланин. биоанализ Culex pipiens Для проверки активности был проведен .
Модель Аланина-Мира
[ редактировать ]Метод сканирования аланина использует тот факт, что большинство канонических аминокислот можно заменить на Ala посредством точковых мутаций, в то время как вторичная структура мутированного белка остается неизменной, поскольку Ala имитирует предпочтения вторичной структуры большинства кодируемых или канонических аминокислот. . Это предсказывает модель Alanine-World .
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Моррисон К.Л., Вайс Г.А. (июнь 2001 г.). «Комбинаторное аланиновое сканирование». Curr Opin Chem Biol . 5 (3): 302–7. дои : 10.1016/S1367-5931(00)00206-4 . ПМИД 11479122 .
- ^ Jump up to: а б Вайс Г.А., Ватанабэ С.К., Чжун А., Годдард А., Сидху С.С. (август 2000 г.). «Быстрое картирование функциональных эпитопов белков путем комбинаторного аланинового сканирования» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 97 (16): 8950–4. Бибкод : 2000PNAS...97,8950W . дои : 10.1073/pnas.160252097 . ПМК 16802 . ПМИД 10908667 .
- ^ Jump up to: а б Симонсен С.М., Сандо Л., Розенгрен К.Дж., Ван С.К., Колгрейв М.Л., Дейли Н.Л., Крейк DJ (апрель 2008 г.). «Аланин-сканирующий мутагенез прототипа циклотида выявляет кластер остатков, необходимых для биологической активности» . Ж. Биол. Хим . 283 (15): 9805–13. дои : 10.1074/jbc.M709303200 . ПМИД 18258598 .
- ^ Jump up to: а б Хоуладер М.Т., Кагава И., Миякава А., Ямамото А., Танигучи Т., Хаякава Т., Сакаи Х. (февраль 2010 г.). «Аланиновое сканирование трех основных петель в домене II комариного токсина Cry4Aa Bacillus thuringiensis» . Прил. Окружающая среда. Микробиол . 76 (3): 860–5. Бибкод : 2010ApEnM..76..860H . дои : 10.1128/АЕМ.02175-09 . ПМК 2813026 . ПМИД 19948851 .
- ^ Гоген Л., Делайн С., Альвино К.Л., МакНил К.А., Уоллес Дж.К., Форбс Б.Е., Де Мейтс П. (июль 2008 г.). «Аланиновое сканирование предполагаемой поверхности связывания рецептора инсулиноподобного фактора роста-I» . Ж. Биол. Хим . 283 (30): 20821–9. дои : 10.1074/jbc.M802620200 . ПМЦ 3258947 . ПМИД 18502759 .
- ^ Jump up to: а б Эдельхейт О, Ханукоглу И, Даскал Н, Ханукоглу А (апрель 2011 г.). «Идентификация роли консервативных заряженных остатков во внеклеточном домене субъединицы эпителиального натриевого канала (ENaC) посредством мутагенеза аланина». Являюсь. Дж. Физиол. Почечная физиол . 300 (4): F887–97. дои : 10.1152/ajprenal.00648.2010 . ПМИД 21209000 . S2CID 869654 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Михелс, Калифорния (2002). Генетические методы биологических исследований: подход к тематическому исследованию . Лондон: Дж. Уайли. п. 111. ИСБН 978-0-471-89921-1 .