Остановил флоу

Остановленная потока -это экспериментальная техника для изучения химических реакций с половиной времени порядка 1 мс, введенного Бриттоном Шансом ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} и продлен Квентином Гибсоном ^{[ 3 ]} (Другие методы, такие как метод температуры , ^{[ 4 ]} доступны для гораздо более быстрых процессов.)

Описание метода

Краткое содержание

с остановленным потоком Спектрометрия позволяет химической кинетике быстрых реакций (с половиной времени порядка миллисекундов) для изучения в растворе. Впервые он использовался в первую очередь для изучения ферментов, катализируемых реакциями. Затем остановленное потоковое расходы быстро обнаружили свое место практически во всей биохимии, биофизике и химических лабораториях с необходимостью следовать химическим реакциям в миллисекундной шкале времени. В своей простейшей форме, остановленная потока смешивает два решения. Небольшие объемы растворов быстро и непрерывно вводится в высокоэффективный микшер. Этот процесс смешивания затем инициирует чрезвычайно быструю реакцию. Недавно смешанный раствор перемещается в ячейку наблюдения и выталкивает содержимое клетки (раствор, оставшийся из предыдущего эксперимента или из необходимых этапов промывки). Время, необходимое для того, чтобы это решение проходило от точки смешивания в точку наблюдения, известно как мертвое время. Минимальный объем впрыска будет зависеть от объема смешанной ячейки. Как только решение было введено для полного удаления предыдущего решения, прибор достигает стационарного состояния, и поток может быть остановлен. В зависимости от технологии шприца, остановка потока достигается с помощью стоп-клапана, называемого жестким стоп или с помощью шприца Stop. Остановленная потока также посылает «начало сигнала» детектору, называемому триггером, чтобы можно было наблюдать реакцию. Время триггера обычно контролируется программным обеспечением, поэтому пользователь может запускать одновременно, когда поток останавливается или за несколько миллисекунд до того, как была достигнута остановка, чтобы проверить стационарное состояние.

Реагенты шприцы

Два шприца заполнены растворами, которые не подвергаются химической реакции, пока не смешаны вместе. У них есть поршни, которые управляются одним поршнем для приводов или независимыми шагами, так что они соединяются вместе, а их содержимое вынуждено одновременно выходить в смешанное устройство.

Смешивающая камера

Ламинарный поток ( слева ) производит мало или вообще не смешивается, но турбулентный поток ( справа ) производит очень быстрое смешивание

После того, как два решения будут вытеснены из их шприц, они входят в систему микширования, которая имеет перегородки, чтобы обеспечить полное смешивание с турбулентным потоком, а не ламинарным потоком. (Ламинарный поток позволил бы двум решениям течь бок о бок с неполным смешиванием.)

Мертвые время

Мертвые время - это время для решений, чтобы перейти от точки смешивания к точке наблюдения, это часть кинетики, которая не может быть замечена. Таким образом, чем ниже мертвые время, тем больше информации может получить пользователь. На более старых инструментах это может быть порядка 1 мс, но улучшения теперь позволяют удержать время около 0,3 мс. ^{[ 5 ]}

Наблюдательная ячейка

Смешанные реагенты проходят клетку наблюдения, которая позволяет спектрофотометрически следовать реакции, обычно с помощью ультрафиолетовой спектроскопии , спектроскопии флуоресценции , кругового дихроизма или рассеяния света , и теперь это часто объединить некоторые из них. ^{[ 6 ]} Наблюдение Кювета с коротким световым путем (от 0,75 до 1,5 мм) обычно предпочтительнее измерений флуоресценции, чтобы уменьшить эффекты самопоглощения. Наблюдение Кювета с более длинным световым путем (от 0,5 см до 1 см) предпочтительнее измерения поглощения. Современный остановленный поток может вместить различные модели ячеек, и можно изменить кювету между двумя экспериментами. Для измерений рентгеновского излучения с остановленным потоком используется кварцевый капилляр с тонкой стеной для минимизации абсорбции кварца. Одновременные измерения рентгеновских лучей и поглощения возможны в одном и том же капилляре.

Остановка

Оказавшись через ячейку наблюдения, смесь попадает в третий шприц, который содержит поршень, который управляется потоком, чтобы активировать переключатель, чтобы остановить поток и активировать наблюдение.

Непрерывный поток

Метод остановленного потока представляет собой разработку метода непрерывного потока, используемого Гамильтоном Хартриджем и Фрэнсисом Гроутоном ^{[ 7 ]} Изучить связывание O ₂ с гемоглобином. При отсутствии какой -либо системы остановки реакционная смесь передавалась в длинную трубку после системы наблюдения (состоящей в 1923 году простого колориметра), чтобы тратить. Перемещая колориметр вдоль трубки и зная скорость потока, Хартридж и Гроутон могут измерить процесс через известное время.

В свое время это был революционный прогресс, показывающий явно неразрешимую проблему (изучение процесса, принимающего миллисекунды с оборудованием, которое требовалось секунды для каждого измерения), можно было решить с помощью простого оборудования. Однако на практике он был ограничен реагентами, доступными в больших количествах: для белков это эффективно ограничивало его реакциями гемоглобина. Для практических целей этот подход устарел.

Утомил поток

Метод остановленного потока зависит от существования спектроскопических свойств, которые могут быть использованы для следования реакции. Когда это не тот случай, угашенный поток обеспечивает альтернативу, которая использует обычные химические методы для анализа. ^{[ 8 ]} Вместо механической системы остановки реакция останавливается при закалке , продукты доставляются получателю, который немедленно останавливает реакцию, либо мгновенным замораживанием, либо путем денатурирования фермента с помощью химического денатура, либо подвергая образец на денатурирующий источник света. Как и в методе непрерывного потока, время между смешиванием и гашением может варьироваться в зависимости от длины трубки.

Метод пульсированного уточенного потока, введенный Аланом Ферштом и Россом Джейксом ^{[ 9 ]} преодолевает необходимость в длинной трубе. Реакция инициируется точно так же, как в эксперименте с остановленным потоком, но существует третий шприц, который приводит к гашению определенного и заданного времени после начала.

Угашенный поток имеет как преимущества, так и недостатки в отношении остановленного потока. С одной стороны, химический анализ дает понять, какой процесс измеряется, тогда как не всегда может быть очевидно, какой процесс представляет спектроскопический сигнал. С другой стороны, уточенный поток гораздо более трудоемкий, так как каждая точка в течение временного курса должна быть определена отдельно. Изображение слева для катализа с помощью нитрогеназы из Klebsiella pneumoniae ^{[ 10 ]} иллюстрирует оба эти точки: соглашение в половине раза указывает на то, что поглощение при 420 нм измеряло высвобождение P _I , но эксперимент по заказу потокового потока требовал 11 точек данных.

Ссылки

^ Шанс, Бриттон (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. I. Ускоренные и остановленные методы для измерения кинетики реакции и спектры нестабильных соединений в видимой области спектра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 619–627. doi : 10.1063/1.1746019 .
^ Шанс, Бриттон; Legallais, Victor (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. II. Прикрепление остановленного потери для стабилизированного кварцевого спектрофотометра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 627–634. doi : 10.1063/1.1746020 .
^ Гибсон, QH (1954). «Остановленное устройство для изучения быстрых реакций». Обсуждения общества Фарадея . 17 : 137. doi : 10.1039/df9541700137 .
^ Эйген, М. (1954). «Методы исследования ионных реакций в водных растворах с половиной раза до 10–9 секунд. Применение к нейтрализации и реакциям гидролиза». Обсуждать. Faraday Soc . 17 : 194–205. doi : 10.1039/df9541700194 .
^ Кларк, Чарльз Р. (1997). «Эксперимент по кинетике с остановленным потоком для продвинутых бакалавриата: формирование тиоцианата железа (III)». Журнал химического образования . 74 (10): 1214. Bibcode : 1997jched..74.1214c . doi : 10.1021/ed074p1214 .
^ Гильерм, Джессика; Фрер, Жан-Мари; Меерсман, Филип; Матань, Андре (2021). «Правоправая параллельная топология β-спиральной камеры эрвинии хризантемемеиметина пектиновой метикластеразы тесно связана как с последовательным складыванием, так и с устойчивостью к высокого давления» . Биомолекулы . 11 (8): 1083. doi : 10.3390/biom11081083 . PMC 8392785 . PMID 34439750 .
^ Hartridge, H.; Гроутон, FJW (1923). «Метод измерения скорости очень быстрых химических реакций» . Труды Королевского общества а . 104 (726): 376–394. Bibcode : 1923rspsa.104..376h . doi : 10.1098/rspa.1923.0116 .
^ Pinsent, Brw (1954). «Метод гашения для изучения быстрых реакций». Обсуждения общества Фарадея . 17 : 140–141. doi : 10.1039/df9541700140 .
^ Fersht, ar; Джейкс, Р. (1975). «Демонстрация двух путей реакции для аминоацилирования переносной РНК: применение техники пульсированного уточенного потока». Биохимия . 14 (15): 3350–3356. doi : 10.1021/bi00686a010 .
^ Торнли, RNF; Корниш-Боуден, А (1977). «Кинетика нитрогеназы Klebsiella-pneumoniae : гетеротропные взаимодействия между магнием-аденозином 5'-дифосфат и магния-аденозин 5'-трифосфат» . Биохимия. Дж . 165 (2): 255–262. doi : 10.1042/bj1650255 . PMC 1164896 . PMID 336036 .

Дальнейшее чтение

Алан Фершт (1998). Структура и механизм в белковой науке: направляющая фермент катализ и складывание белка . Нью -Йорк: WH Freeman. С. 132–168. ISBN 9780716732686 .
Ател Корниш-Боуден (2012). Основы кинетики фермента (4 -е изд.). Вейнхейм: Wiley-Blackwell. С. 391–396. ISBN 978-3527330744 .

[1] Шанс, Бриттон (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. I. Ускоренные и остановленные методы для измерения кинетики реакции и спектры нестабильных соединений в видимой области спектра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 619–627. doi : 10.1063/1.1746019 .

[2] Шанс, Бриттон; Legallais, Victor (1951). «Быстрая и чувствительная спектрофотометрия. II. Прикрепление остановленного потери для стабилизированного кварцевого спектрофотометра». Обзор научных инструментов . 22 (8): 627–634. doi : 10.1063/1.1746020 .

[3] Гибсон, QH (1954). «Остановленное устройство для изучения быстрых реакций». Обсуждения общества Фарадея . 17 : 137. doi : 10.1039/df9541700137 .

[4] Эйген, М. (1954). «Методы исследования ионных реакций в водных растворах с половиной раза до 10–9 секунд. Применение к нейтрализации и реакциям гидролиза». Обсуждать. Faraday Soc . 17 : 194–205. doi : 10.1039/df9541700194 .

[5] Кларк, Чарльз Р. (1997). «Эксперимент по кинетике с остановленным потоком для продвинутых бакалавриата: формирование тиоцианата железа (III)». Журнал химического образования . 74 (10): 1214. Bibcode : 1997jched..74.1214c . doi : 10.1021/ed074p1214 .

[6] Гильерм, Джессика; Фрер, Жан-Мари; Меерсман, Филип; Матань, Андре (2021). «Правоправая параллельная топология β-спиральной камеры эрвинии хризантемемеиметина пектиновой метикластеразы тесно связана как с последовательным складыванием, так и с устойчивостью к высокого давления» . Биомолекулы . 11 (8): 1083. doi : 10.3390/biom11081083 . PMC 8392785 . PMID 34439750 .

[7] Hartridge, H.; Гроутон, FJW (1923). «Метод измерения скорости очень быстрых химических реакций» . Труды Королевского общества а . 104 (726): 376–394. Bibcode : 1923rspsa.104..376h . doi : 10.1098/rspa.1923.0116 .

[8] Pinsent, Brw (1954). «Метод гашения для изучения быстрых реакций». Обсуждения общества Фарадея . 17 : 140–141. doi : 10.1039/df9541700140 .

[9] Fersht, ar; Джейкс, Р. (1975). «Демонстрация двух путей реакции для аминоацилирования переносной РНК: применение техники пульсированного уточенного потока». Биохимия . 14 (15): 3350–3356. doi : 10.1021/bi00686a010 .

[10] Торнли, RNF; Корниш-Боуден, А (1977). «Кинетика нитрогеназы Klebsiella-pneumoniae : гетеротропные взаимодействия между магнием-аденозином 5'-дифосфат и магния-аденозин 5'-трифосфат» . Биохимия. Дж . 165 (2): 255–262. doi : 10.1042/bj1650255 . PMC 1164896 . PMID 336036 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]