Пакетная культура ФРС
 | Возможно, эту статью необходимо реорганизовать, чтобы она соответствовала рекомендациям Википедии по оформлению . ( Апрель 2014 г. ) |
Периодическая культура с подпиткой в самом широком смысле определяется как метод работы в биотехнологических процессах, при котором одно или несколько питательных веществ (субстратов) подаются (поставляются) в биореактор во время культивирования и при котором продукт(ы) остаются в биореакторе до тех пор, пока конец пробега. [1] Альтернативным описанием метода является описание культуры, в которой «основная среда поддерживает исходную культуру клеток , а питательная среда добавляется для предотвращения истощения питательных веществ». [2] Это также разновидность полупериодической культуры . В некоторых случаях все питательные вещества подаются в биореактор. Преимущество периодической культуры с подпиткой состоит в том, что можно контролировать концентрацию подпитываемого субстрата в культуральной жидкости на произвольно желаемом уровне (во многих случаях на низком уровне).
Вообще говоря, периодическая культура с подпиткой превосходит обычную периодическую культуру, когда контроль концентрации питательного вещества (или питательных веществ) влияет на выход или продуктивность желаемого метаболита.
Виды биопроцессов
[ редактировать ]Типы биопроцессов, для которых периодическая культура с подпиткой эффективна, можно резюмировать следующим образом:
1. Субстратное ингибирование [1]
Такие питательные вещества, как метанол, этанол, уксусная кислота и ароматические соединения, подавляют рост микроорганизмов даже в относительно низких концентрациях. Путем правильного добавления таких субстратов можно сократить время задержки и заметно уменьшить ингибирование роста клеток.
2. Высокая плотность клеток (высокая концентрация клеток) [1]
В периодической культуре для достижения очень высоких концентраций клеток, например 50-100 г сухих клеток/л, необходимы высокие начальные концентрации питательных веществ в среде. При таких высоких концентрациях питательные вещества становятся ингибирующими, хотя при нормальных концентрациях, используемых в периодических культурах, они не оказывают такого эффекта.
3. Эффект глюкозы ( эффект Крэбтри ) [1]
При производстве пекарских дрожжей из солодового сусла или патоки с начала 1900-х годов было признано, что этанол производится даже в присутствии достаточного количества растворенного кислорода (РК), если в культуральной жидкости присутствует избыток сахара. Этанол является основной причиной низкого выхода клеток. Аэробное образование этанола в присутствии концентрации глюкозы известно как эффект глюкозы или эффект Крэбтри. Чтобы уменьшить этот эффект, при производстве хлебопекарных дрожжей обычно используется периодический процесс с подпиткой. В аэробных культурах Escherichia coli и Bacillus subtilis органические кислоты, такие как уксусная кислота (и в меньших количествах молочная кислота и муравьиная кислота), образуются в качестве побочных продуктов при высокой концентрации сахара. Эти кислоты ингибируют рост клеток, а также проявляют ухудшающее влияние на метаболическую активность. Образование этих кислот называется бактериальным эффектом Крэбтри.
4. Катаболитная репрессия [1]
Когда микроорганизму предоставляется быстро метаболизируемый источник углеродной энергии, такой как глюкоза, результирующее увеличение внутриклеточной концентрации АТФ приводит к подавлению биосинтеза ферментов, что приводит к замедлению метаболизма источника энергии. Это явление известно как катаболитная репрессия. Многие ферменты, особенно те, которые участвуют в катаболических путях, подвержены этой репрессивной регуляции. Мощным методом преодоления катаболитной репрессии в биосинтезе ферментов является периодическая культура с подпиткой, при которой концентрация глюкозы в культуральной жидкости поддерживается на низком уровне, при этом рост ограничивается, а биосинтез фермента подавляется. Медленное поступление глюкозы при ферментации пенициллина Penicillium chrysogenum является классическим примером в этой категории.
5. Ауксотрофные мутанты [1]
В микробном процессе с использованием ауксотрофного мутанта (мутанта, нуждающегося в питательных веществах) избыточное обеспечение необходимыми питательными веществами приводит к обильному росту клеток с небольшим накоплением желаемого метаболита из-за ингибирования по обратной связи и/или репрессии конечного продукта. Однако недостаток необходимых питательных веществ снижает рост клеток, а также общее производство желаемого метаболита, поскольку скорость производства обычно пропорциональна концентрации клеток. В таком биопроцессе накопление желаемого метаболита можно максимизировать, выращивая мутант на ограниченном количестве необходимого питательного вещества. Для культивирования мутанта на низкой концентрации необходимого питательного вещества его вводят в периодическую культуру с контролируемой скоростью. Этот метод часто используется при промышленном производстве аминокислот с использованием ауксотрофных мутантов. Примером является продукция лизина у гомосерин- или треонин/метионин-требующего мутанта Corynebacterium glutamicum, у которого отсутствует ген гомосериндегидрогеназы.
6. Контроль экспрессии гена с репрессируемым промотором.
Транскрипция гена, имеющего репрессируемый промотор перед открытой рамкой считывания, репрессируется за счет комбинации так называемого голорепрессора с операторной областью ДНК. Когда определенное химическое соединение существует в культуральной жидкости, это соединение (или его метаболит) в клетках объединяется в качестве ко-репрессора с апо-репрессором (разновидностью транскрипционного фактора), образуя голорепрессор. Поддержание концентрации этого соединения на минимально возможном уровне (при этом обеспечивая достаточный рост клеток) позволяет продолжать экспрессию регулируемого гена. Пакетная культура ФРС — мощный инструмент для достижения этой цели. Примерами репрессируемого промотора являются промотор trp и промотор phoA .
7. Увеличение времени работы, восполнение потери воды при испарении и снижение вязкости культурального бульона. [1]
Типы стратегий культивирования
[ редактировать ]Культура с высокой плотностью клеток
[ редактировать ]Стратегия периодического питания с подпиткой обычно используется в биопромышленных процессах для достижения высокой плотности клеток в биореакторе . [3] [4] [5] [6] Чаще всего питательный раствор имеет высокую концентрацию, чтобы избежать разбавления биореактора.Продукция гетерологичных белков периодическими культурами рекомбинантных микроорганизмов с подпиткой широко изучалась. [7] [8] [9] [10]
Контролируемое добавление питательного вещества напрямую влияет на скорость роста культуры и помогает избежать переполнения метаболизма (образование побочных метаболитов, таких как ацетат для Escherichia coli , молочной кислоты в культурах клеток млекопитающих, этанола для Saccharomyces cerevisiae ), ограничения кислорода (анаэробиоз). ). [11] [12]
Периодическая культура с постоянной подпиткой
[ редактировать ]Простейшей периодической культурой с подпиткой является та, в которой скорость подачи субстрата, ограничивающего рост, постоянна, т.е. скорость подачи инвариантна во время культивирования. Этот случай показан на графике (здесь объем культуры является переменным). Этот тип периодической культуры с подпиткой называется периодической культурой с постоянной подпиткой (CFBC) и хорошо известен математически. [13] и экспериментально. [14] В CFBC были изучены оба случая CFBC фиксированного и переменного объема.
Экспоненциальная периодическая культура
[ редактировать ]В идеальных условиях клетки растут экспоненциально. Если скорость подачи рост-лимитирующего субстрата увеличить пропорционально экспоненциальной скорости роста клеток, можно поддерживать удельную скорость роста клеток в течение длительного времени, сохраняя при этом концентрацию субстрата в культуральной жидкости на постоянном уровне. уровень. Требуемая скорость подачи (объемная или массовая) должна увеличиваться в геометрической прогрессии со временем, так что этот режим периодической культуры с подпиткой называется периодической культурой с экспоненциальной подпиткой (EFBC). [15]
Ограничение субстрата дает возможность контролировать скорость реакции, чтобы избежать технологических ограничений, связанных с охлаждением реактора и переносом кислорода. Ограничение субстрата также позволяет осуществлять метаболический контроль, чтобы избежать осмотических эффектов, репрессии катаболитов и избыточного метаболизма побочных продуктов. [16] [17] [18]
Стратегия контроля
[ редактировать ]Для контроля роста в периодическом процессе с подпиткой можно использовать различные стратегии:
| Параметр управления | Принцип управления |
|---|---|
| ДОТ (pO 2 ) | DOstat (DOT= константа), F~DOT |
| Скорость поглощения кислорода (OUR) | OUR=константа, F~OUR |
| Глюкоза | онлайн-измерение уровня глюкозы (FIA), глюкоза=постоянная |
| Ацетат | оперативное измерение ацетата (FIA), ацетат=константа |
| pH (рНстат) | F~pH (подкисление связано с высоким содержанием глюкозы) |
| Аммиак | оперативное измерение аммиака (FIA), аммиак=постоянный |
| Температура | Т адаптирован по OUR или p O 2 |
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Цунео Ямане, Шоичи Симидзу: Методы периодической подпитки в микробных процессах. Достижения в области биохимии/Biotechnol 1984, 30:147-194.
- ^ Нгибуини, Мваи (25 ноября 2014 г.). «Как одноразовые мини-биореакторы могут революционизировать масштабирование биопроцессов» . Фармацевтическая обработка . США: Advantage Business Media. Архивировано из оригинала 20 октября 2015 года . Проверено 28 ноября 2014 г.
- ^ с высокой плотностью клеток Дитер Ризенберг: Культивирование Escherichia coli . Карр Опин Биотехнологий 1991, 2:380-384.
- ^ Л. Йи, Харви В. Бланч: Экспрессия рекомбинантного белка в периодических культурах Escherichia coli с высокой плотностью клеток с подпиткой . Био/Технология (Нью-Йорк), 1992, 10:1550-1556.
- ^ с высокой плотностью клеток Сан Юп Ли: Культура Escherichia coli . Тенденции Биотехнологии 1996, 14:98-105.
- ^ ДжозефШилоах, Рефаэль Фасс: Выращивание E. coli до высокой плотности клеток - исторический взгляд на разработку метода. Биотехнология Адв 2005, 23:345-357.
- ^ О Мендоса-Вега, Дж. Сабати, С.В. Браун: Промышленное производство гетерологичных белков с помощью периодических культур дрожжей Saccharomyces-cerevisiae с подпиткой . Обзоры микробиологии FEMS 1994, 15:369-410.
- ^ Паулина Бальбас: Понимание искусства производства белковых и небелковых молекул в Escherichia coli. Молекулярная биотехнология 2001, 19:251-267.
- ^ Нойбауэр П., Винтер Дж.: Стратегии экспрессии и ферментации для производства рекомбинантного белка в Escherichia coli . В: Мертен О.В. и др. (Редс). Производство рекомбинантного белка с помощью прокариотических и эукариотических клеток. Сравнительный взгляд на физиологию хозяина. 2001, Kluwer Academic Publisher, Дордрехт, Нидерланды. стр. 195-258.
- ^ Амуля К. Панда: Биообработка терапевтических белков из телец включения Escherichia coli . Adv Biochem Eng Biotechnol 2003, 85:43-93.
- ^ Чонсок Ли, Сан Юп Ли, Сувон Пак, Антон П.Дж. Мидделберг: Контроль периодического брожения с подпиткой. Биотехнология Адв 1999, 17:29-48.
- ^ Кэти Ф. Влашин, Вэй-Шоу Ху: Периодическая культура с подпиткой и динамическое кормление питательными веществами. Adv Biochem Engin/Biotechnol 2006, 101:43-74.
- ^ Цунео Яманэ, Сигэки Хирано: Полупериодическая культура микроорганизмов с постоянной подачей субстрата - математическое моделирование -. J Ferment Technol 1977, 55:156-165.
- ^ Цунео Яманэ, Сигэки Хирано: Полупериодическая культура микроорганизмов с постоянной подачей субстрата - Экспериментальное исследование -. J Ferment Technol 1977, 55:380-387.
- ^ Цунео Ямане, Мичимаса Кисимото, Фумитаке Ёсида: Полупериодическое культивирование метанол-ассимилирующих бактерий с экспоненциально увеличенной подачей метанола. J Ferment Technol 1974, 54:229-240.
- ^ Дж. Чжан, Рэндольф Гришам: Среды химического определения для коммерческих ферментаций. Прикладная микробиология и биотехнология 1999, 51:407-421.
- ^ Гуннар Лиден: Понимание биореактора. Биопроцессы и биосистемная инженерия 2002, 24:273-279.
- ^ Кристофер Дж. Хьюитт, Элвин В. Ниноу : Масштабирование процессов периодической микробной ферментации и периодической ферментации с подпиткой. Adv Appl Microbiol 2007, 62:105-135.