Уравнение щита

Прямолинейный график, соответствующий гипотетическим точкам. График Шильда обратимого конкурентного антагониста должен представлять собой прямую линию с линейным градиентом, точка пересечения оси Y которого соответствует силе антагониста.

В фармакологии вызванную регрессионный анализ Шильда , основанный на уравнении Шильда , названном в честь Хайнца Отто Шильда , является инструментом для изучения влияния агонистов и антагонистов на реакцию, рецептором , или на связывание лиганд-рецептор.

Концепция

Кривые «доза-реакция» могут быть построены для описания реакции или образования комплекса лиганд-рецептор в зависимости от концентрации лиганда. Антагонисты затрудняют образование этих комплексов, ингибируя взаимодействие лиганда с его рецептором. Это рассматривается как изменение кривой доза-эффект: обычно сдвиг вправо или понижение максимума. Обратимый конкурентный антагонист должен вызвать сдвиг вправо кривой доза-эффект, так что новая кривая будет параллельна старой, а максимум не изменится. Это связано с тем, что обратимые конкурентные антагонисты являются преодолимыми антагонистами. Величину сдвига вправо можно определить количественно с помощью коэффициента дозы r. Отношение доз r представляет собой соотношение дозы агониста, необходимой для достижения половины максимального ответа от антагониста. ${\ce {B}}$ настоящее, разделенное на агонист, необходимый для получения половины максимального ответа без антагониста («контроль»). Другими словами, соотношение EC50 ингибированных и неингибированных кривых. Таким образом, r представляет собой как силу антагониста, так и концентрацию примененного антагониста. Уравнение, полученное на основе уравнения Гаддума, можно использовать для связи r с $[{\ce {B}}]$ , следующее:

r=1+{\frac {[{\ce {B}}]}{K_{B}}}

где

r - коэффициент дозы
$[{\ce {B}}]$ это концентрация антагониста
$K_{B}$ - константа равновесия связывания антагониста с рецептором

График Шильда представляет собой двойной логарифмический график, обычно $\log _{10}(r-1)$ как ордината и $\log _{10}[{\ce {B}}]$ как абсцисса . Это делается путем логарифма по основанию 10 обеих частей предыдущего уравнения после вычитания 1:

\log _{10}(r-1)=\log _{10}[{\ce {B}}]-\log _{10}(K_{B})

Это уравнение линейно относительно $\log _{10}[{\ce {B}}]$ , что позволяет легко строить графики без вычислений. Это было особенно ценно до того, как использование компьютеров в фармакологии стало широко распространенным. Пересечение оси Y уравнения представляет собой отрицательный логарифм $K_{B}$ и может использоваться для количественной оценки силы антагониста.

Эти эксперименты необходимо проводить в очень широком диапазоне (следовательно, в логарифмическом масштабе), поскольку механизмы различаются в больших масштабах, например, при высоких концентрациях лекарства. ^{[ нужна ссылка ]}

Подгонку графика Шильда к наблюдаемым точкам данных можно выполнить с помощью регрессионного анализа .

Регрессия Шильда для связывания лигандов

Хотя в большинстве экспериментов в качестве меры эффекта используется клеточный ответ, эффект, по сути, является результатом кинетики связывания; Итак, чтобы проиллюстрировать механизм, лиганда используется связывание . Лиганд А будет связываться с рецептором R в соответствии с константой равновесия:

K_{d}={\frac {k_{-1}}{k_{1}}}

Хотя константа равновесия более значима, в текстах часто упоминается ее обратная константа, константа сродства (K _aff = k ₁ /k _-1 ): лучшее связывание означает увеличение сродства связывания.

Уравнение связывания простого лиганда с одним гомогенным рецептором:

[AR]={\frac {[R]_{t}\,[A]}{[A]+K_{d}}}

^{[ нужны разъяснения ]}

Это уравнение Хилла-Лэнгмюра, которое практически представляет собой уравнение Хилла, описанное для связывания агониста. В химии это соотношение называется уравнением Ленгмюра , которое описывает адсорбцию молекул на участках поверхности (см. Адсорбция ).

$[R]_{t}$ — общее количество мест связывания, а при построении уравнения — это горизонтальная асимптота, к которой стремится график; По мере увеличения концентрации лиганда будет занято больше сайтов связывания, но 100% заселенность никогда не будет. Сродство связывания представляет собой концентрацию, необходимую для занятия 50% сайтов; чем ниже это значение, тем легче лиганду занять место связывания.

Связывание лиганда с рецептором в равновесном состоянии следует той же кинетике, что и фермент в стационарном состоянии ( уравнение Михаэлиса-Ментен ), без превращения связанного субстрата в продукт.

Агонисты и антагонисты могут оказывать различное влияние на связывание лиганда. Они могут изменить максимальное количество сайтов связывания, сродство лиганда к рецептору, оба эффекта вместе или даже более причудливые эффекты, когда изучаемая система более интактна, например, в образцах тканей. (Поглощение тканей, десенсибилизация и другие неравновесные состояния могут быть проблемой.)

Преодолимый препарат меняет аффинность связывания:

конкурентный лиганд: $K_{d}'=K_{d}{\frac {1+[B]}{K_{b}}}$
кооперативный аллостерический лиганд: $K_{d}'=K_{d}{\frac {K_{B}+[B]}{K_{B}+{\frac {[B]}{\alpha }}}}$ ^{[ нужны разъяснения ]}

Непреодолимый препарат меняет максимальное связывание:

неконкурентное связывание: $[R]'_{t}={\frac {[R]_{t}}{1+{\frac {[B]}{K_{b}}}}}$
необратимое связывание

Регрессия Шильда также может выявить наличие более одного типа рецепторов и показать, был ли эксперимент проведен неправильно, поскольку система не достигла равновесия.

Анализы связывания радиолигандов

Первый радиорецепторный анализ (RRA) был проведен в 1970 году Лефковицем и др., ^{[ сомнительно – обсудить ]} использование радиоактивно меченного гормона для определения сродства связывания с его рецептором. ^[1]

Радиорецепторный анализ требует отделения связанного лиганда от свободного. Это делается путем фильтрации , центрифугирования или диализа . ^[2]

Методом, не требующим разделения, является сцинтилляционный анализ близости , основанный на том факте, что β-лучи от ³H преодолевают чрезвычайно короткие расстояния. Рецепторы связаны с шариками, покрытыми полигидроксисцинтиллятором. Обнаруживаются только связанные лиганды.

Сегодня метод флуоресценции предпочтительнее радиоактивных материалов из-за гораздо более низкой стоимости, меньшей опасности и возможности мультиплексирования реакций с высокой производительностью. Одна из проблем заключается в том, что лиганды, меченные флуоресцентной меткой, должны нести объемистый флуорофор, который может препятствовать связыванию лиганда. Поэтому используемый флуорофор, длину линкера и его положение необходимо тщательно выбирать.

Примером может служить использование FRET , где флуорофор лиганда передает свою энергию флуорофору антитела, выработанного против рецептора.

Другие методы обнаружения, такие как поверхностный плазмонный резонанс, даже не требуют флуорофоров.

См. также

Зависимость доза-реакция

Ссылки

^ Лефковиц Р.Дж., Рот Дж., Пастан I (ноябрь 1970 г.). «Радиорецепторный анализ адренокортикотропного гормона: новый подход к определению полипептидных гормонов в плазме». Наука . 170 (3958): 633–635. Бибкод : 1970Sci...170..633L . дои : 10.1126/science.170.3958.633 . ПМИД 4319388 . S2CID 41878471 .
^ де Йонг Л.А., Угес Д.Р., Франке Дж.П., Бишофф Р. (декабрь 2005 г.). «Анализ связывания рецептора с лигандом: технологии и применение». Журнал хроматографии. Б. Аналитические технологии в биомедицине и науках о жизни . 829 (1–2): 1–25. дои : 10.1016/j.jchromb.2005.10.002 . ПМИД 16253574 .

Дальнейшее чтение

Кенакин Т. (1993). Фармакологический анализ взаимодействия препарата с рецептором . Нью-Йорк: Рэйвен Пресс.

Внешние ссылки

Curvefit.com — Кривые «доза-реакция» в присутствии антагонистов , для ясного объяснения.

[pmid4319388-1] Лефковиц Р.Дж., Рот Дж., Пастан I (ноябрь 1970 г.). «Радиорецепторный анализ адренокортикотропного гормона: новый подход к определению полипептидных гормонов в плазме». Наука . 170 (3958): 633–635. Бибкод : 1970Sci...170..633L . дои : 10.1126/science.170.3958.633 . ПМИД 4319388 . S2CID 41878471 .

[pmid16253574-2] де Йонг Л.А., Угес Д.Р., Франке Дж.П., Бишофф Р. (декабрь 2005 г.). «Анализ связывания рецептора с лигандом: технологии и применение». Журнал хроматографии. Б. Аналитические технологии в биомедицине и науках о жизни . 829 (1–2): 1–25. дои : 10.1016/j.jchromb.2005.10.002 . ПМИД 16253574 .

[1]

[2]