Brb-seq
Огромная РНК штрих-кодирование и секвенирование ( BRB-Seq с сверхэгротиком ) представляет собой технологию MRNA-Seq , которая использует матросную штрих-штрих и уникальные молекулярные идентификаторы (UMI), чтобы обеспечить объединение до 384 образцов в одной трубе (UMI). В начале рабочего процесса подготовки библиотеки секвенирования. Транскриптомная технология совместима как с Illumina и MGI . инструментами секвенирования с коротким чтением [ 1 ]
При стандартном секвенировании РНК библиотека секвенирования должна быть подготовлена для каждого образца РНК индивидуально. [ 2 ] Напротив, в BRB-seq все образцы объединяются на ранних этапах рабочего процесса для одновременной обработки, чтобы сократить затраты и время, необходимое на этапе подготовки библиотеки. [ 1 ]
Поскольку BRB-seq представляет собой метод секвенирования 3'-мРНК, короткие чтения генерируются только для 3'-области полиаденилированных молекул мРНК, а не для полной длины транскриптов, как в стандартном секвенировании РНК . Это означает, что BRB-seq требует гораздо меньшей глубины секвенирования на образец для получения полногеномных транскриптомных данных, которые позволяют пользователям обнаруживать такое же количество экспрессируемых генов и дифференциально экспрессируемых генов, что и стандартный подход Illumina TruSeq, но по цене до 25 раз дешевле. или аналогично профилированию четырех генов с использованием RT-qPCR . [ 1 ] BRB-seq также обладает большей устойчивостью к более низкому качеству РНК (RIN <6), когда транскрипты разрушаются, поскольку для подготовки библиотеки требуется только 3'-область. [ 1 ]
История
[ редактировать ]Метод BRB-seq был впервые опубликован в апреле 2019 года в рецензируемом журнале Genome Research в рукописи под названием «BRB-seq: сверхдоступная высокопроизводительная транскриптомика, обеспечиваемая массовым штрих-кодированием и секвенированием РНК». [ 1 ] По итогам 2019 года статья вошла в десятку самых читаемых статей журнала и цитировалась более 150 раз. [ 3 ] (апрель 2024 г.).
Методика была разработана в Федеральной политехнической школе Лозанны в Швейцарии в лабораториях профессора Барта Депланке и его сотрудников. В мае 2020 года была создана компания Alithea Genomics, которая предоставляет BRB-seq в виде наборов для исследователей или в виде полного сервиса. [ 4 ] BRB-seq основан на технологических достижениях в области транскриптомики отдельных клеток , где штрих-кодирование образцов сделало возможным раннее мультиплексирование сотен и тысяч отдельных клеток. Мультиплексирование образцов позволило исследователям создавать единые библиотеки секвенирования, содержащие несколько различных образцов, что позволило снизить общие затраты на эксперименты и время выполнения работ, а также значительно повысить производительность. [ 5 ]
BRB-seq применяет эти достижения в области штрих-кодирования образцов и мРНК к мРНК, полученным из массовых популяций клеток, чтобы обеспечить сверхвысокопроизводительные исследования, имеющие решающее значение для открытия лекарств , популяционных исследований или фундаментальных исследований . [ 1 ] [ 6 ]
Метод
[ редактировать ]Фундаментальным аспектом BRB-seq являются оптимизированные праймеры для штрих-кодов образцов. Каждая нуклеотидная последовательность со штрих-кодом включает в себя адаптер для отжига праймера, штрих-код длиной 14 нуклеотидов, который присваивает уникальный идентификатор каждому отдельному образцу РНК, и случайный UMI длиной 14 нуклеотидов, который помечает каждую молекулу мРНК уникальной последовательностью, чтобы отличать исходную мРНК. транскрипты и дубликаты, возникающие в результате систематической ошибки амплификации ПЦР. BRB-seq позволяет объединить до 384 образцов РНК с индивидуальным штрих-кодом в одну пробирку на ранних этапах рабочего процесса, чтобы упростить последующие этапы подготовки и секвенирования библиотеки кДНК . [ 1 ] [ 7 ] [ 8 ]
Требования к входной РНК
Для изолированных образцов тотальной РНК требуется RIN ≥ 6 и соотношение A260/230 ˃ 1,5 при количественном определении с помощью Nanodrop. Для стандартного BRB-seq рекомендуется от 10 нг до 1 мкг очищенной РНК на образец. Чтобы обеспечить единообразие библиотеки и равномерное распределение чтений для каждого образца после секвенирования, концентрация РНК на входной образец, их RIN и значения 260/230 должны быть как можно более однородными. [ 1 ]
Рабочий процесс
Рабочий процесс BRB-seq начинается с добавления изолированных образцов РНК в отдельные лунки 96- или 384-луночного планшета. Затем каждый образец подвергается независимой обратной транскрипции со штрих-кодом после добавления уникальных оптимизированных праймеров олиго(dT) со штрих-кодом. Эти праймеры уникальным образом помечают 3'-поли(А)-хвост молекул мРНК во время синтеза первой цепи кДНК. Информация о прядях сохраняется. Поскольку каждый образец РНК имеет индивидуальный штрих-код, после этого первого этапа все образцы из 96- или 384-луночного планшета можно объединить в одну пробирку для одновременной обработки.
После объединения образцов в одну пробирку свободные праймеры расщепляются. Реакция синтеза второй цепи затем приводит к образованию двухцепочечной кДНК (DS кДНК).
Затем эти полноразмерные молекулы кДНК подвергаются процессу, называемому тегментацией, которому способствует транспозаза Tn5, предварительно загруженная адаптерами, необходимыми для амплификации библиотеки. Транспозаза сначала фрагментирует молекулы кДНК, а затем лигирует предварительно загруженные адаптеры с этими фрагментами кДНК. Более высокая сложность библиотеки возникает при использовании около 20 нг кДНК на образец для мечения, а это означает, что требуется меньше циклов ПЦР-амплификации.
Для совместимости с секвенаторами Illumina полученную библиотеку кДНК затем индексируют и амплифицируют с использованием уникальной стратегии двойного индексирования (UDI) с индексами P5 и P7. Эти индексы минимизируют риск неправильного присвоения штрих-кода после секвенирования следующего поколения.
Информация о среднем размере фрагментов библиотек затем необходима для оценки молярности библиотек и подготовки соответствующего разведения библиотеки для секвенирования. Успешная библиотека содержит фрагменты в диапазоне 300–1000 п.н. с пиком 400–700 п.н.
В отличие от стандартных методов массового секвенирования РНК, которые требуют около 30 миллионов чтений на образец для получения достоверной информации об экспрессии генов, для BRB-seq глубина секвенирования от одного до пяти миллионов чтений на образец достаточна для обнаружения большинства экспрессируемых генов в образце. . Слабо экспрессируемые гены можно обнаружить путем секвенирования на большей глубине.
Данные секвенирования BRB-seq можно анализировать с помощью стандартных методов транскриптомного анализа с открытым исходным кодом, таких как STARsolo, предназначенных для выравнивания мультиплексированных данных и создания матриц количества генов и UMI для последующего анализа РНК-seq из необработанных файлов fastq.
Приложения
[ редактировать ]BRB-seq подходит для любого исследования, требующего полногеномных транскриптомных данных. Он особенно подходит для исследований сотен или тысяч образцов благодаря масштабируемому, простому и быстрому рабочему процессу, который подходит для автоматизации.
Открытие лекарств на основе искусственного интеллекта и токсигеномика
[ редактировать ]Искусственному интеллекту требуется огромное количество обучающих данных, чтобы прийти к надежным выводам о целевых или нецелевых биологических эффектах лекарств и их токсикогеномных профилях. BRB-seq — это экономичная и быстрая технология секвенирования, которая позволяет фармацевтическим компаниям извлекать больше транскриптомных данных с меньшими затратами для исследования фармакологического воздействия тысяч молекул на интересующие клетки одновременно и в большом масштабе. [ 9 ]
Фундаментальные исследования
[ редактировать ]BRB-seq использовался для открытия нового типа клеток, который ингибирует образование жира у людей, что потенциально может улучшить лечение ожирения и диабета 2 типа. [ 10 ] определить экспрессию иммунных генов, активируемых SARS-CoV-2 при разных температурах, в клетках дыхательных путей человека. [ 11 ] и обнаружить гены, которые включаются или выключаются у плодовой мухи в разное время суток. [ 12 ]
Агригеномика
[ редактировать ]Исследователи также использовали Plant BRB-seq в агротранскриптомике для изучения транскриптомной реакции кукурузы на азотные удобрения. Они обнаружили дифференциальную экспрессию подмножества генов, реагирующих на стресс, в ответ на изменение уровня удобрений. [ 13 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Альперн, Дэниел; Гардо, Винсент; Рассел, Джули; Манжеат, Бастьен; Мейрелеш-Фильо, Антонио, Калифорния; Брейсс, Романе; Хакер, Дэвид; Депланке, Барт (19 апреля 2019 г.). «BRB-seq: сверхдоступная транскриптомика с высокой пропускной способностью, обеспечиваемая массовым штрих-кодированием и секвенированием РНК» . Геномная биология . 20 (1): 71. дои : 10.1186/s13059-019-1671-x . ISSN 1474-760X . ПМК 6474054 . ПМИД 30999927 .
- ^ Старк, Рори; Гржелак, Марта; Хэдфилд, Джеймс (24 июля 2019 г.). «Секвенирование РНК: подростковые годы» . Обзоры природы Генетика . 20 (11): 631–656. дои : 10.1038/s41576-019-0150-2 . ISSN 1471-0056 . ПМИД 31341269 .
- ^ «БРБ-сек» . Гугл ученый . Проверено 27 апреля 2024 г.
- ^ «Алитея Геномика | Крупномасштабное секвенирование РНК» . alitheagenomics.com . Проверено 25 апреля 2024 г.
- ^ Цигенхайн, Кристоф; Вит, Беате; Парех, Свати; Рейниус, Бьёрн; Гийоме-Адкинс, Эми; Сметс, Марта; Леонхардт, Генрих; Хейн, Хольгер; Хеллманн, Инес; Энард, Вольфганг (февраль 2017 г.). «Сравнительный анализ методов секвенирования одноклеточных РНК» . Молекулярная клетка . 65 (4): 631–643.е4. doi : 10.1016/j.molcel.2017.01.023 . hdl : 10230/34928 . ISSN 1097-2765 . ПМИД 28212749 .
- ^ Спрэафико, Роберт; Сориага, Лия Б.; Гросс, Джон; Верджин, Герберт В.; Теленти, Амалио (август 2020 г.). «Достижения в области геномики для разработки лекарств» . Гены . 11 (8):942.doi : 10.3390 /gene11080942 . ISSN 2073-4425 . ПМК 7465049 . ПМИД 32824125 .
- ^ Цигенхайн, Кристоф; Вит, Беате; Парех, Свати; Рейниус, Бьёрн; Гийоме-Адкинс, Эми; Сметс, Марта; Леонхардт, Генрих; Хейн, Хольгер; Хеллманн, Инес; Энард, Вольфганг (16 февраля 2017 г.). «Сравнительный анализ методов секвенирования одноклеточных РНК» . Молекулярная клетка . 65 (4): 631–643.e4. doi : 10.1016/j.molcel.2017.01.023 . hdl : 10230/34928 . ISSN 1097-4164 . ПМИД 28212749 .
- ^ Сена, Джонни А.; Галотто, Джулия; Девитт, Нико П.; Конник, Мелани С.; Якоби, Дженнифер Л.; Умале, Пуджа Э.; Видали, Луис; Белл, Каллум Дж. (3 сентября 2018 г.). «Уникальные молекулярные идентификаторы открывают новый артефакт секвенирования, который можно использовать для анализа экспрессии генов на основе RNA-Seq» . Научные отчеты . 8 (1): 13121. Бибкод : 2018NatSR...813121S . дои : 10.1038/s41598-018-31064-7 . ISSN 2045-2322 . ПМК 6120941 . ПМИД 30177820 .
- ^ Сингх, Аджай Викрам; Чандрасекар, Вайсали; Паудель, Намуна; Ло, Питер; Луч, Андреас; Джеммати, Донато; Тисато, Вероника; Прабху, Кирти С.; Уддин, Шахаб; Дакуа, Сарада Прасад (июль 2023 г.). «Интегративная токсикогеномика: развитие точной медицины и токсикологии с помощью искусственного интеллекта и технологий OMIC» . Биомедицина и фармакотерапия . 163 : 114784. doi : 10.1016/j.biopha.2023.114784 . HDL : 11392/2510430 . ISSN 0753-3322 . ПМИД 37121152 .
- ^ Швали, Петра К.; Донг, Хуа; Захара, Магда; Рассел, Джули; Альперн, Дэниел; Акчиче, Нассила; Капрара, Кристиан; Сунь, Вэньфэй; Шлаудрафф, Кай-Уве; Солдати, Джанни; Вольфрум, Кристиан; Депланке, Барт (20 июня 2018 г.). «Популяция стромальных клеток, которая ингибирует адипогенез в жировых отложениях млекопитающих» . Природа . 559 (7712): 103–108. Бибкод : 2018Natur.559..103S . дои : 10.1038/s41586-018-0226-8 . ISSN 0028-0836 . ПМИД 29925944 .
- ^ Вьковский, Филипп; Гултом, Митра; Келли, Дженна; Штайнер, Сильвио; Рассел, Джули; Манжеат, Бастьен; Кора, Элиза; Пецольдт, Йорн; Холверда, Мелле (27 апреля 2020 г.). «Различная температурозависимая динамика вируса – хозяина SARS-CoV-2 и SARS-CoV в респираторном эпителии человека» . dx.doi.org . дои : 10.1101/2020.04.27.062315 . Проверено 25 апреля 2024 г.
- ^ Литовченко Мария; Мейрелеш-Фильо, Антонио, Калифорния; Фрошо, Майкл В.; Беверс, Роул П.Дж.; Прунотто, Алессио; Андуага, Ане Мартин; Холлис, Брайан; Гардо, Винсент; Браман, Вирджиния С.; Рассел, Джули MC; Каденер, Себастьян; даль Пераро, Маттео; Депланке, Барт (29 января 2021 г.). «Обширные вариации тканеспецифической экспрессии и новые регуляторы, лежащие в основе циркадного поведения» . Достижения науки . 7 (5): eabc3781. Бибкод : 2021SciA....7.3781L . дои : 10.1126/sciadv.abc3781 . ISSN 2375-2548 . ПМЦ 7846174 . ПМИД 33514540 .
- ^ Ин, Шэн; Вебстер, Брэндон; Гомес-Кано, Лина; Шивайя, Киран-Кумар; Ван, Цяньцзе; Ньютон, Линси; Гротеволд, Эрих; Томпсон, Адди; Лундквист, Питер К. (31 октября 2023 г.). «Многомасштабные физиологические реакции гибридов кукурузы на азотные добавки» . Физиология растений . 195 : 879–899. дои : 10.1093/plphys/kiad583 . ISSN 0032-0889 . ПМК 11060684 . ПМИД 37925649 .